[发明专利]飞蝗Rab5基因及其dsRNA在飞蝗防治中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及飞蝗Rab5基因及其dsRNA在飞蝗防治中的应用。本发明具体通过生物信息学方法，从飞蝗转录组中获取飞蝗小GTP酶基因5的片段，进一步设计合成其对应的引物，进行PCR扩增，扩增产物测序后，得到飞蝗Rab5基因，序列如SEQ ID NO：1所示。进一步，依据SEQ ID NO：1，设计并合成相应的引物，PCR扩增得到核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的基因片段，将该基因片段按照试剂盒说明书体外转录合成dsRNA，将其注射进入飞蝗体腔后可以特异性沉默靶标基因，使飞蝗在蜕皮时死亡，多次实验表明其致死率达到100％。由于本发明dsRNA的特异性及高效的致死率，对于飞蝗防治具有重要的现实意义，可为飞蝗防治提供新的途径。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种飞蝗Rab5基因及其在飞蝗防治中的应用。

背景技术

飞蝗由于迁飞、繁殖能力强和食性杂等特点导致其分布范围极广，蝗灾一旦暴发会对粮食生产造成严重危害。目前对于蝗灾的防治主要是化学杀虫剂，长期使用化学杀虫剂带来了蝗虫抗药性的产生、农药残留、食品安全隐患以及环境污染等多方面的问题。因此，研发绿色环保有效的新型生物杀虫剂迫在眉睫。

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引发的特异性转录后基因沉默现象，这一现象在1998年被Andrew Fire和Craig C.Mello两位科学家正式命名，并于2006年获得诺贝尔生理及医学奖。由于该技术对靶基因的高效性、特异性及易操作性等特点，已经在基因功能研究、基因治疗药物的开发及作物病虫害的防治方面展示了广阔的应用前景。采用RNA干扰技术进行害虫防治具有如下优点：1)杀虫专一性强，对非靶标生物无杀伤作用；2)绿色环保性，RNA在自然界极易降解，无残留。因此，学者将其称为第四代新型杀虫剂的核心技术。基于RNA干扰进行害虫防治的关键是筛选靶标序列获得对昆虫具有高致死作用的dsRNA。

生物体为保证细胞各种功能的有序进行，一些关键的功能蛋白需要被准确的招集到细胞特定的位置来发挥作用，研究表明小GTP酶Rab5在这一过程中发挥着重要作用。Rab5是细胞内各种膜组分(membrane component)运输的关键调节因子，主要参与质膜和早期内含体之间物质的运输。在无活性的GDP结合形式和有活性的GTP结合形式之间循环，不同状态的Rab5可以募集不同的下游效应物。越来越多的研究表明，Rab5在调控细胞自噬、线粒体稳态维持、染色质排列整合等具有重要作用。沉默该靶标基因后昆虫生命活动不能正常进行，导致其不能正常发育最终死亡。

发明内容

针对上述问题本发明首先提供了一种飞蝗小GTP酶基因5(LmRab5)，本发明还提供了基于LmRab5基因全长序列合成的dsRNA及其在飞蝗防治中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

本发明提供一种飞蝗小GTP酶基因5(LmRab5)，其全长的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该序列长1130bp，包含645bp开放阅读框，编码214个氨基酸。

本发明提供一种飞蝗Rab5基因的获得方法，包括以下步骤：

步骤1，基于飞蝗转录组数据库，采用生物信息学方法搜索飞蝗Rab5基因的序列；

步骤2，根据步骤1获得的序列，设计并合成其上、下游引物；

步骤3，提取飞蝗3龄若虫总RNA，采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA，获得PCR扩增反应所需模板；

步骤4，利用步骤2的引物和步骤3的模板，通过PCR扩增反应获得飞蝗Rab5基因。

进一步，所述步骤2中上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示。