[发明专利]一种尿液中修饰核苷及肌酐同时测定的方法

说明书

本发明涉及液相质谱联用技术领域，公开了一种尿液中修饰核苷及肌酐同时测定的方法，具体包括以下步骤：(1)尿样预处理制备得到待测样本；(2)待测混合标准溶液制备：称取修饰核苷标准品和肌酐标准品，溶解稀释得到不同浓度的标准溶液；称取同位素内标物，溶解稀释得到一定浓度的内标溶液；将上述标准品溶液与内标溶液进行混合得到待测混合标准溶液；(3)将待测样本和待测混合标准溶液进行液质联用检测，得到修饰核苷的种类和含量；本发明提供的检测方法中，通过将尿样进行蛋白沉淀和稀释，能够有效的对尿液中的修饰核苷和肌酐进行同时的定性和定量分析。该方法无需复杂的前处理，大大简化了样品前处理的步骤，有效提高肌酐检测灵敏度，有效避免个体样本差异引起的测定误差，极大的提高了修饰核苷定量的准确性。

技术领域

本发明涉及液相质谱联用技术领域，具体涉及一种尿液中修饰核苷及肌酐同时测定的方法。

背景技术

近年，关于尿液修饰核苷在肿瘤标志物的研究中颇多，在正常细胞中修饰核苷比较稳定，它不像未修饰的核苷会经过再利用通道重新生成RNA或者被各种水解酶水解成尿酸，β-氨基丙酸，β-氨基异丁酸等，而是直接分泌到体外，因此正常成年人个体间核苷排放浓度差异较小，浓度分布在较窄的范围。而在肿瘤发生和发展的过程中，RNA修饰酶高度活跃，且tRNA代谢速率远高于正常细胞，修饰核苷大量排泄到体液中，恶性肿瘤中的tRNA明显区别于正常组织的tRNA,表现为其修饰的核苷种类较多。因此尿中修饰核苷的含量基本反映了tRNA的代谢速度，因而成为多种肿瘤诊断和监测的潜在信号，例如，乳腺癌，头颈癌，胃癌，食道癌，结直肠癌等。

目前，已有报道采用液质联用的方法在分析前需要对尿液中的修饰核苷进行固相萃取，再进行检测。除此之外，肌酐能够标准化各种排泄化合物的水平，肾脏功能损伤不严重时，尿液中肌酐的排泄较少受尿液稀释以及浓缩的影响，因此通常用尿液中肌酐含量作为尿中其他物质排泄的参照物，而已经报道过的文献是基于碱性苦味酸分光光度计法或者高效液相色谱法对尿液中的肌酐进行定量，需要分开检测修饰核苷和肌酐，过程过于繁琐，耗费时间，因此需要一种前处理操作简单、检测高效且同时分析尿液修饰核苷和肌酐的方法。该检测方法基于多反应监测MRM模式，通过内标法对尿液修饰核苷和肌酐定量，以尿液修饰核苷与肌酐的浓度比来作为尿样中修饰核苷的最终含量(nmol/μmol Cr)。

现有技术存在尿液中的修饰核苷需进行富集、肌酐检测灵敏度不高、人体样本差异导致测量误差较大等不足。

发明内容

本发明的目的在于提供一种尿液中修饰核苷和肌酐同时检测新方法。本发明针对需要对尿液中的修饰核苷进行富集、肌酐检测灵敏度不高、人体样本差异导致测量误差较大等现有技术的不足，本发明提供了一种尿液中修饰核苷及肌酐的同时检测方法，具体包括如下步骤：尿液去除蛋白后稀释，采用液质联用技术，实现尿液样本中修饰核苷和肌酐的同时定性和定量检测。

本发明提供的尿液中修饰核苷及肌酐的同时检测方法，包括以下步骤：

(1)尿样预处理制备得到待测样本；

(2)待测混合标准溶液制备：称取修饰核苷标准品和肌酐标准品，溶解稀释得到不同浓度的标准溶液；称取同位素内标物，溶解稀释得到一定浓度的内标溶液；将上述标准品溶液与内标溶液进行混合得到待测混合标准溶液；

(3)将待测样本和待测混合标准溶液进行液质联用检测，得到修饰核苷的种类和含量；

任选的，步骤(1)待测样本中还可以加入内标物。

其中，修饰核苷标准品包括但不限于腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、肌苷(I)、N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基胞苷(m5C)、3-甲基胞苷(m3C)、5-甲基尿苷(m5U)、3-甲基尿苷(m3U)、N,N-二甲基鸟苷(m²₂G)、假尿嘧啶核苷(Psu)、尿苷(U)、1-甲基鸟苷(m1G)、1-甲基腺苷(m1A)、6-O-甲基鸟苷(O6-MeG)、1-甲基次黄苷(m1I)、N4-乙酰胞苷(ac4C)和肌酐(Cr)等。