[发明专利]ZNF382稳定转染的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株构建方法及应用在审
| 申请号： | 202011635086.7 | 申请日： | 2020-12-31 |
| 公开（公告）号： | CN113151358A | 公开（公告）日： | 2021-07-23 |
| 发明（设计）人： | 王慧睿;郭淑利;肖蓬莉;刘思哲;彭靓;陈聪;唐莉;黄磊;李治 | 申请（专利权）人： | 洛阳市中心医院（郑州大学附属洛阳中心医院） |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N15/12;C12N5/10 |
| 代理公司： | 重庆市信立达专利代理事务所(普通合伙) 50230 | 代理人： | 陈炳萍 |
| 地址： | 471009 河南*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | znf382 稳定 转染 弥漫 细胞 淋巴瘤 细胞株 构建 方法 应用 | ||
1.ZNF382稳定转染的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：慢病毒包装和病毒浓缩
培养获得待转染293T细胞25ml，将含有ZNF382基因序列的ZNF382慢病毒过表达质粒和辅助质粒混合后与150μL转染试剂混合，室温放置12min后共转染293T细胞，转染6-8h后换液，分别于24h、48h、72h收集含有病毒的培养基上清，将3次收集的含有病毒的培养基上清混合后，4℃2000r/rnin离心10min，获取上清，用聚乙二醇浓缩法沉淀病毒；
S2：慢病毒感染DLBCL细胞
检测步骤S1中的ZNF382过表达组慢病毒滴度，ZNF382过表达组的病毒滴度为5×108TU/ml；在DLBCL细胞株处于对数生长期时，加入MOI值为100的浓缩病毒液，并使ploybrene终浓度为8μg/ml，感染12h后，将培养基更换为新鲜培养基，感染48h后，更换为含1μg/ml嘌呤霉素条件的培养基进行筛选，最终获得阳性感染细胞，即得ZNF382稳定转染的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，含有ZNF382基因序列的ZNF382慢病毒过表达质粒为pCDH-CMV-ZNF382-GFP，加入量为21μg；辅助质粒包括17.5μgpSPAX2和7μgpMD2.G。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中的聚乙二醇浓缩法沉淀病毒的具体方法如下：
A.应用0.45μm PES材质的滤膜过滤上清，并配置5X PEG8000+NaCl母液；
B.每30ml过滤后的病毒初始液加入5X PEG-8000+NaCl母液7.5ml，冰上混匀5h，每30min混合一次，于4℃、4000g离心2h，吸弃上清，4℃、4000g离心5min，吸走残余液体后加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀，集中后的病毒悬液分装速冻后储存在-80℃。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，5X PEG8000+NaCl母液的配制方法如下：称取NaCl 8.766g、PEG800050g溶解在200ml Milli-Q纯水中，121℃30min湿热灭菌，保存在4℃即可。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S2中的DLBCL细胞包括OCI-LY10细胞和U2932细胞。
6.权利要求1-5任意一项所述的构建方法构建的细胞株在制备用于研究或治疗DLBCL的产品中的应用。
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