[发明专利]ZNF382稳定转染的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株构建方法及应用

说明书

本发明涉及生物医学领域，公开了ZNF382稳定转染的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株构建方法，包括慢病毒包装和病毒浓缩和慢病毒感染DLBCL细胞；还公开了构建的细胞株的应用。本发明构建的细胞株有助于拓宽对DLBCL发病机制的认识，为去甲基化药物在临床上应用于DLBCL和临床治疗DLBCL的研究提供了更稳定可靠的实验材料。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及ZNF382稳定转染的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株构建方法及应用。

背景技术

弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是一组高度异质性和侵袭性的恶性肿瘤，是最常见的一类淋巴瘤。目前随着抗CD20单抗的应用以及造血干细胞移植和CAR-T的开展，DLBCL患者的生存结局得到了显著改善，但由于DLBCL的异质性以及患者耐药和复发等问题，其治疗仍面临巨大挑战。因此，深入研究DLBCL的发病机制、寻找具有治疗潜力的新型靶标具有重要的临床现实意义。近年来，多项研究表明基因异常和生物学改变是DLBCL发生和演进的重要起始因素，识别新的异常甲基化基因可能会对DLBCL的发生有更好的理解，有助于为DLBCL的治疗提供新的理论依据和治疗靶点。KRAB锌指蛋白(KRAB-ZFPs)是机体最常见的一类转录因子，其在进化过程中高度保守。不同KRAB-ZFP在肿瘤中发挥着不同的生物学作用，且越来越多的研究表明多种KRAB-ZFP在恶性肿瘤中存在异常甲基化现象，参与恶性肿瘤的发生发展过程。因此揭示KRAB-ZFP基因的DNA甲基化调控及其转录调控分子机制对早期发现癌变、判断临床预后等具有重要意义。ZNF382是KRAB-ZFP蛋白家族的成员之一，定位于19p13.12，文献报道在白血病及胃癌中均存在启动子区域甲基化异常或表达下调，该基因可能是一个潜在的抑癌基因，但具体机制尚未阐明。目前对于其他血液恶性肿瘤还鲜有对ZNF382的报道，其生物学功能及其分子作用机制还尚待阐明。

为了探讨ZNF382在DLBCL中的表观调控及其生物学功能，需要检测DLBCL骨髓组织及其细胞株中ZNF382的表达，并通过MSP、去甲基化药物处理等方法检测DLBCL骨髓组织及其细胞株中ZNF382的甲基化状态；需要构建ZNF382稳定转染的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株，并通过CCK-8细胞增殖实验和Transwell迁移实验等探讨ZNF382对DLBCL细胞生物学功能的影响，以促进DLBCL的临床治疗研究。

发明内容

基于以上问题，本发明提供ZNF382稳定转染的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株构建方法及应用，本发明构建的细胞株有助于拓宽对DLBCL发病机制的认识，为去甲基化药物在临床上应用于DLBCL和临床治疗DLBCL的研究提供了更稳定可靠的实验材料。

为解决以上技术问题，本发明提供了ZNF382稳定转染的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株构建方法，包括如下步骤：

S1：慢病毒包装和病毒浓缩

培养获得待转染293T细胞25ml，将含有ZNF382基因序列的ZNF382慢病毒过表达质粒和辅助质粒混合后与150μL转染试剂混合，室温放置12min后共转染293T细胞，转染6-8h后换液，分别于24h、48h、72h收集含有病毒的培养基上清，将3次收集的含有病毒的培养基上清混合后，4℃2000r/rnin离心10min，获取上清，用聚乙二醇浓缩法沉淀病毒；

S2：慢病毒感染DLBCL细胞

检测步骤S1中的ZNF382过表达组慢病毒滴度，ZNF382过表达组的病毒滴度为5×10⁸TU/ml；在DLBCL细胞株处于对数生长期时，加入MOI值为100的浓缩病毒液，并使ploybrene终浓度为8μg/ml，感染12h后，将培养基更换为新鲜培养基，感染48h后，更换为含1μg/ml嘌呤霉素条件的培养基进行筛选，最终获得阳性感染细胞，即得ZNF382稳定转染的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株。