[发明专利]一种产假尿苷工程菌及其应用

权利要求书

1.一种产假尿苷工程菌，其特征在于，利用基因工程技术在宿主菌中表达假尿苷合成相关的基因，得到可产假尿苷的基因工程菌；

所述宿主菌为大肠杆菌；

所述假尿苷合成相关的基因为：腺苷酸激酶编码基因pumH、tRNA假尿苷合酶编码基因pumJ和HAD（卤代酸脱卤酶）蛋白家族水解酶编码基因pumD；

所述基因pumH、pumJ和pumD，其DNA序列均来源于链霉菌Streptomycessp. ID38640，序列分别如SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列、 SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列和SEQ IDNo. 6所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的产假尿苷工程菌，其特征在于，所述的宿主菌为大肠杆菌DH5α。

3.根据权利要求1所述的产假尿苷工程菌，其特征在于，所述的编码基因pumH蛋白序列、编码基因pumJ蛋白序列和编码基因pumD蛋白序列均来源于链霉菌Streptomyces sp.ID38640，分别为SEQ ID No. 1 所示的基因pumH蛋白序列、SEQ ID No. 2所示的基因pumJ蛋白序列和SEQ ID No. 3所示的基因pumD蛋白序列。

4.一种产假尿苷工程菌，其特征在于，利用基因工程技术在宿主菌中表达假尿苷合成相关的基因，得到可产假尿苷的基因工程菌；

所述宿主菌为大肠杆菌；

所述假尿苷合成相关的基因为：腺苷酸激酶编码基因pumH、tRNA假尿苷合酶编码基因pumJ和HAD（卤代酸脱卤酶）蛋白家族水解酶编码基因pumD；

所述的基因pumH、pumJ和pumD，其DNA序列按照大肠杆菌密码子偏好性进行优化，优化后的序列分别如SEQ ID No. 7所示的核苷酸序列、 SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列和SEQID No. 9所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的产假尿苷工程菌，其特征在于，包括对所述的密码子偏好性优化后的基因pumH、pumJ和pumD进行修饰，具体为pumH密码子优化后的核酸序列在起始密码子前连接启动子Ptrp序列，pumJ和pumD密码子优化后的核酸序列在起始密码子前连接RBS序列aaaggaggatatacat，修饰后序列分别如SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列、 SEQ IDNo. 11所示的核苷酸序列和SEQ ID No. 12所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的产假尿苷工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）pumH+Ptrp序列和载体pUC18分别用HindIII+SphI酶切，然后用T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组菌落pZH423；

（2）pumJ+RBS序列和载体pZH423分别用XbaI+SphI酶切，然后用T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组菌落pZH424；

（3）pumD+RBS序列和载体pZH424分别用XbaI+KpnI酶切，然后用T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组菌落pZH425，即产假尿苷工程菌。

7.一种如权利要求1所述的产假尿苷工程菌在产假尿苷中的应用。

8.一种产假尿苷的方法，其特征在于：将权利要求1~5之一所述的产假尿苷工程菌进行发酵培养得到假尿苷；

所述的发酵过程pH维持在6.5-7.6之间，采用柠檬酸水溶液或乙酸水溶液与氨水组合进行调节。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的发酵培养基中添加肌苷。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的肌苷以溶于氢氧化钠的水溶液的形式加入，所述的发酵培养基中肌苷的初始终浓度为1.0-10 g/L。