[发明专利]一种产假尿苷工程菌及其应用

说明书

本发明提供了一种产假尿苷工程菌及其应用，所述工程菌是将来源于链霉菌Streptomyces sp.ID38640中的假尿苷合成基因pumH、pumJ和pumD基因克隆至大肠杆菌体内，转化得到可产假尿苷的工程菌，可产假尿苷达7g/L以上。本发明大肠杆菌基因构建方法简单，发酵过程中不需要添加诱导剂异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷即可获得较高产量的假尿苷，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种产假尿苷工程菌及其应用。

背景技术

1957年，DAV I S等在核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)和转运RNA(transferRNA，tRNA)中首次发现一种与尿嘧啶核苷天然结构类似的异构体，其核糖不与尿嘧啶(Uridine，U)N1相连，而与C5相连，形成假尿嘧啶核苷(Pseudouridine，PU)。(DAVIS F F，ALLEN FW.Ribonucleic acids from yeast which contain a fifth nucleotide[J].J BiolChem，1957，227(2)：907-915.)尿苷通过假尿苷合酶从核糖糖碱基裂解并重新连接生成C-C糖苷键，异构化成假尿苷。尿嘧啶核苷与假尿嘧啶核苷化学结构式如式1所示。

作为核苷尿苷的一种异构体，假尿苷存在于除信使RNA外的许多类RNA中，包括tRNA和rRNA。假尿苷是非编码RNA中含量最多的修饰核苷，通过稳定RNA结构来增强转移RNA和核糖体RNA的功能。假尿苷是由假尿苷合酶催化得来的，这种酶在转录后将RNA中特定的尿苷异构化，这个过程被称为假尿苷化。假尿苷作为核苷酸代谢物，对其的研究越来越受到学者们的重视。假尿苷可作为一个潜在的生物标志物，用于肾病与肿瘤的诊断、疗效监测，而且对于其他疾病的诊断也有一定的参考意义。研究表明，假尿苷可以减少辐射引起的人类淋巴细胞染色体畸变。近年来，科学家推测假尿苷在RNA稳定性和/或帮助氨基酰基转移酶与tRNAs相互作用方面发挥作用。另外，随着生物技术的飞速发展，利用核酸适配体、RNA干扰等手段发现的基因组药物引起了人们的兴趣，根据其特殊的生理功能，假尿苷被用作医药中间体，假尿苷的磷脒衍生物被用作合成此类低聚物的起始材料之一。

在假尿苷制备方面，现目前，只有传统的化学合成法可催化合成假尿苷，但是，针对假尿苷的化学合成，存在化学合成步骤长、收率低，且用到的试剂易燃易爆，较不安全等一系列的问题。在生物合成方面，尚未发现可专一大量用于假尿苷制备的微生物菌种和技术报道。因此，假尿苷的低成本便捷式获取存在一定的缺陷。

针对现有技术中假尿苷只能通过化学合成法制备，且化学合成过程中存在的合成步骤长、收率低，且用到的试剂易燃易爆，较不安全等一系列的问题，寻求一种通过基因工程构建可发酵产假尿苷的工程菌，并可通过简单的发酵和较低的成本实现假尿苷的生产。

发明内容

为了解决假尿苷现有制备方法不足的问题，本发明提供了一种产假尿苷工程菌及其应用，包括以下步骤：利用基因工程技术在大肠杆菌中表达假尿苷合成相关的基因，得到可产假尿苷的基因工程菌株；

所述假尿苷合成相关基因的蛋白序列为：腺苷酸激酶编码基因pumH蛋白序列、tRNA假尿苷合酶编码基因pumJ蛋白序列和HAD(卤代酸脱卤酶)蛋白家族水解酶编码基因pumD蛋白序列；

为了解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明的技术方案之一为：一种产假尿苷工程菌，利用基因工程技术在宿主菌中表达假尿苷合成相关的基因，得到可产假尿苷的基因工程菌。

本发明所述的宿主菌包括不限于细菌、藻和真菌，其中，细菌优选自大肠杆菌，进一步，优选为大肠杆菌DH5α。

进一步，作为优选的，所述假尿苷合成相关的基因为：腺苷酸激酶编码基因pumH、tRNA假尿苷合酶编码基因pumJ和HAD(卤代酸脱卤酶)蛋白家族水解酶编码基因pumD。