[发明专利]一种多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法

权利要求书

1.一种多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法，该方法包括：

第一轮次杂交：采用带有荧光分子标记的多种探针对待测样本进行第一轮次荧光原位杂交；

成像：对杂交后的样本进行荧光成像；

解离：对已经杂交上的探针分子进行解离；

第二轮次以上的重复杂交及成像：对解离后的样本进行第二轮次或更多轮次的杂交并荧光成像，形成多轮次的荧光成像；其中前一轮次的已经杂交的探针分子进行解离后再进行下一轮次杂交；

根据多轮次荧光成像情况鉴定微生物；

其中，每轮次的杂交过程均采用带有荧光分子标记的多种探针；每一轮次中，所述多种探针特异性靶向两种以上的微生物，多种探针带有的荧光分子标记包括两种以上；多轮次中每种探针所带有的荧光分子标记至少两种。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，每轮次的杂交过程均采用带有荧光分子标记的M种探针；共形成N轮次的荧光成像；各轮次的多种探针带有的荧光分子标记共包括A种；

其中，M为大于2的正整数，N为大于2的正整数，A为大于等于2的正整数；

优选地，M为选自3～200的正整数，N为选自4～50的正整数，A为选自3～5的正整数；

更优选地，各轮次的多种探针带有的荧光分子标记包括FAM、Cy3和Cy5。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，杂交过程包括将待测样本与工作液接触静置孵育的过程，其中所述工作液为含有所述带有荧光分子标记的多种探针的杂交液；优选地，杂交液中含有NaCl(氯化钠)、Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液)、SDS(十二烷基硫酸钠)和甲酰胺；

优选地，每轮次杂交后采用洗脱液洗去非特异性杂交，之后再进行荧光成像；更优选地，所述洗脱液中含有NaCl、Tris-HCl和EDTA(乙二胺四乙酸)。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，解离过程包括将杂交后的待测样本与解离液接触静置孵育以将已经杂交到微生物上的探针分子从微生物上解离的过程；

优选地，解离液中含有甲酰胺、Tris-HCl和EDTA；

更优选地，解离后对样本进行显微成像以验证解离效果。

5.根据权利要求4所述的方法，其中：

解离液中，甲酰胺的体积浓度为60-100％；优选地，Tris-HCl浓度为0.01～0.03mol/L，EDTA浓度为0.005～0.01mol/L。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述微生物包括细菌、真菌、古菌中的一种或多种；

优选地，所述探针为靶向预定微生物的转录产物或DNA基因座的探针。

7.根据权利要求1或2或6所述的方法，其中，所述探针满足与靶向微生物的ΔG小于-13.0kcal/mol并与非靶向微生物拥有至少三个中间错配碱基；

优选地，所述探针满足与非靶向微生物的ΔG大于-7.3kcal/mol。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，每种探针在各轮次中所带有的荧光分子按照轮次顺序形成对应该探针的荧光编码，两种探针在同一轮次中的荧光分子不同定义为1个距离，多种探针的荧光编码两两之间具有至少3个、优选至少4个距离。

9.根据权利要求6～8任一项所述的方法，其还包括：在进行多轮杂交前，根据探针的ΔG与荧光强度的分布关系，确定荧光编码方案。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，待测样本来自人体、动物、植物和/或环境；优选地，该方法是应用于检测样本中所包含的微生物群落在微米尺度上的物种组成和/或空间结构。