[发明专利]一种多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法

说明书

本发明提供了一种多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法，该方法包括：采用带有荧光分子标记的多种探针对待测样本进行第一轮次荧光原位杂交；对杂交后的样本进行荧光成像；对已经杂交上的探针分子进行解离；对解离后的样本进行第二轮次或更多轮次的杂交并荧光成像，形成多轮次的荧光成像；其中前一轮次的已经杂交的rRNA分子与探针分子进行解离后再进行下一轮次杂交；根据多轮次荧光成像情况鉴定微生物。本发明的方法，通过多轮、多色的荧光原位杂交，同时结合高容错的编码方案，可以同时对一个样本中所有微生物物种进行空间定位，可用于解析不同样本所包含的复杂微生物群落在微米尺度上的物种组成和空间结构。

技术领域

本发明属于微生物鉴定技术领域，具体而言是关于一种利用多轮、多色荧光原位杂交来鉴定微生物的方法。

背景技术

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是一种基于碱基互补配对原则使用荧光标记的核酸探针靶向细胞内特定核酸序列的染色技术。在微生物检测方面，基于所设计探针的特异性，荧光标记的18-25碱基长度的寡核苷酸探针靶向到目标细菌的核糖体RNA，可以实现从种到门不同水平的微生物鉴定。无需进行细胞培养，荧光原位杂交技术不仅能对混合菌群中的特定微生物进行鉴定，还可以提供菌群的形态和空间位置信息。

然而在实际的荧光成像中，由于有机荧光染料间存在激发串扰和发射渗漏，可以同时使用的荧光团数量有限。因此，常规的荧光原位杂交实验只能一次鉴定一种或几种类型的微生物。Gary G.Borisy等人提出了一种组合标记和光谱成像的方法(CLASI-FISH)，对每一种细菌的特异性探针进行两种不同颜色的荧光分子修饰，然后同时使用两种荧光分子标记的探针靶向细菌(Proc.Natl.Acad.Sci.108,4152–4157(2011))。选用8种荧光分子进行荧光分子的两两组合，则可获得28种不同荧光分子的组合，从而实现对28种不同细菌的标记。之后通过线性分离算法对图像中的荧光信号进行分析处理，获取该细菌成像中荧光发射信号最强的两种荧光分子进而判定该细菌种类，从而实现28种细菌的同时成像。

然而，由于荧光染料间存在的激发串扰和发射渗漏，组合标记和光谱成像的方法可以同时使用的荧光分子数目仍然有限(10个左右)，因而对同一个样本的一个选定区域，可以同时成像的微生物物种数量有限(几十种)，可拓展性不高。并且随着选用的荧光分子数目的增加，对显微镜的配置要求也会越来越高，需要更多的激光器(比如6-7个激光)，而常规的显微镜通常是配备4个激光器。此外，随着可同时成像微生物物种数量的增加，针对每种不同微生物设计出高度特异性探针的困难也随之加大。由于探针是靶向到核糖体序列，对于一些亲缘关系相近的微生物物种，其核糖体序列相似度较高，会限制可同时成像的微生物种类数量。进一步地，该方法难以运用到组织中细菌的原位成像。由于组织样本中邻近的细菌经常重叠，因而在进行光谱分离时难以准确判定该细菌的两种荧光分子组合，从而无法鉴定细菌类别。因此，对于组织样本中多细菌(当细菌种数大于十种时)进行空间结构成像分析时，只能分批对不同样本中的不同细菌进行标记，无法实现同一样本多细菌的同时成像。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种鉴定微生物的新方法，以准确提高同一样本同一区域可同时成像的不同种微生物的物种数量。

为达上述目的，本发明提供了一种多轮、多色荧光原位杂交鉴定微生物的方法，该方法包括：

第一轮次杂交：采用带有荧光分子标记的多种探针对待测样本进行第一轮次荧光原位杂交；

成像：对杂交后的样本进行荧光成像；

解离：对已经杂交上的探针分子进行解离；

第二轮次以上的重复杂交及成像：对解离后的样本进行第二轮次或更多轮次的杂交并荧光成像，形成多轮次的荧光成像；其中前一轮次的已经杂交的探针分子进行解离后再进行下一轮次杂交；

根据多轮次荧光成像情况鉴定微生物；