[发明专利]重组质粒、重组基因VII型新城疫病毒及其培养方法

权利要求书

1.一种重组质粒pBR322-FDHN3-S1，其特征在于，其序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.一种如权利要求1所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，将F1片段、F2片段、F3片段、S1片段同源重组得到重组质粒pBR322-FDHN3-S1；

所述S1片段的序列分别如SEQ ID NO：2所示；

所述F1片段、F2片段的制备方法为：以pBR322-FDHN3载体为模板用分别用引物，FDHN3-F1/FDHN3-SmaI-R1；FDHN3-SmaI-F2/FDHN3-R2扩增长度为1463bp的F1，和长度为4845bp的F2 PCR片段；

所述pBR322-FDHN3载体、引物FDHN3-F1、FDHN3-SmaI-R1、FDHN3-SmaI-F2、FDHN3-R2的序列如序列表SEQ ID NO：3～7所示；

所述F3片段的制备方法为：

用SmaI酶切pBR322-FDHN3载体，并通过胶纯化大小为13996bp的DNA片段F3。

3.根据权利要求2所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，所述S1片段的制备方法为：

步骤1：取含IBV病毒的鸡胚尿囊液，按核酸提取试剂盒步骤，提取总RNA；

步骤2：使用反转录试剂盒，获取病毒cDNA；

步骤3：S1片段扩增与纯化，取病毒cDNA为模板，加入酶、引物、无菌水，扩增S1片段，PCR产物鉴定正确后，使用胶回收试剂盒，纯化回收S1基因片段；

所述引物为S1-F和S1-R；

引物S1-F和S1-R的序列如序列表SEQ ID NO：8～9所示。

4.一种重组基因VII型新城疫病毒，其特征在于，将如权利要求1所述的重组质粒pBR322-FDHN3-S1转染BHK-21细胞，得到重组基因VII型新城疫病毒rFDHN3-S1。

5.一种如权利要求4所述的新城疫病毒的无血清悬浮的方法，其特征在于，取稀释至细胞密度为2.5-3.5×10⁶cells/mL的MDCK细胞悬液；将重组基因VII型新城疫病毒rFDHN3-S1体系至病毒含量为0.0001～1MOI，并同时加入TPCK胰酶，置于CO₂震荡培养箱培养48～96h。

6.根据如权利要求5所述的新城疫病毒的无血清悬浮的方法，其特征在于，所述MDCK细胞悬液在使用前需要传代培养，所述MDCK细胞传代培养方法为：

将传代MDCK细胞加入到含100mL培养基的三角摇瓶中，置于CO₂震荡培养箱，设置温度37℃，转速为120rpm/min，当细胞密度达到8.0～9.0×10⁶cells/mL时，取适当细胞悬液加入到新鲜培养基中，使培养体系总体积为100ml，细胞密度约为1.5×10⁶cells/mL，培养至细胞密度为8.0～9.0×10⁶cells/mL，重复以上过程。

7.根据如权利要求5所述的新城疫病毒的无血清悬浮的方法，其特征在于，所述方法具体为：

取细胞密度达到8.0～9.0×10⁶cells/mL MDCK细胞悬液，按比例稀释至细胞密度为3×10⁶cells/mL，培养体系50ml；取病毒滴度为10^8.0EID50/0.1ml rFDHN3-S1重组新城疫病毒，按比例加入体系至病毒含量为0.0001～1MOI，并同时按4mg/L加入TPCK胰酶，置于CO₂震荡培养箱，设置温度37℃，转速为120rpm/min培养48～96h。

8.根据如权利要求5-7任一所述的新城疫病毒的无血清悬浮的方法，其特征在于，所述病毒含量为0.01MOI；培养时间为72h；培养所得的病毒的病毒效价为10^8.26EID50/0.1ml。