[发明专利]重组质粒、重组基因VII型新城疫病毒及其培养方法

说明书

本发明属于生物领域，公开了一种重组质粒pBR322‑FDHN3‑S1，其序列如序列表SEQ ID NO：1所示。该重组质粒采用强毒性的VII亚型NDV毒株DHN3株为基础，用Lasota弱毒株的F基因替换了DHN3株的F基因，插入S1基因，针对II型、VII型新城疫和IBV具有免疫源性。同时，本发明还公开了一种重组病毒以及针对该病毒的高滴度培养方法。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种重组质粒、重组基因VII型新城疫病毒及其培养方法。

背景技术

鸡新城疫(ND)、鸡传染性支气管炎(IB)分别是由新城疫病毒(NDV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)感染引起的的鸡急性、高度传染性病毒疾病，两种病毒对不同年龄段、性别和品种的鸡均易感，均能导致鸡群出现呼吸系统、消化系统、生殖系统等疾病，甚至死亡。在养禽生产中，两种病毒混合感染常有发生，能进一步加重疫病情况，严重影响鸡群健康及生产效益。对于上述疫病必须严防死守，目前疫苗防控是最主要手段。随着我国养禽业的快速发展，规模越发加大，对于家禽疫病的防控不仅有利于产业发展，提升经济效益，还有食品安全及人类健康息息相关，因此制备安全有效疫苗有着重要意义。为提高免疫效率，基于基因VII型新城疫病毒及传染性支气管炎病毒S1蛋白，利用反向遗传方式，构建了rFDHN3-S1重组新城疫弱毒疫苗候选株。

目前，新城疫疫苗主要应用全病毒灭活疫苗和全病毒弱毒疫苗，其制备方式主要采用鸡胚接种和原代细胞转瓶培养。上述工艺生产的的疫苗在疫病防控过程起重要作用。但在长期实践过程，人们发现鸡胚、转瓶疫苗在生产和应用上存在外源病毒污染风险、生产废物散毒污染风险、批间差异性风险、杂蛋白含量高以致免疫副作用风险，其安全性和稳定性均有待提高。因此，急需选择和革新的新城疫病毒疫苗、传染性支气管炎疫苗生产介质及工艺。

近年来，基于细胞无血清悬浮培养的病毒抗原悬浮培养技术广泛应用于生物制药行业，相对于鸡胚和转瓶培养，无血清悬浮培养技术具有单位产量高、生产效率高、条件可控性强、污染风险低、外源蛋白含量低、批间差异小、成本低等优点，使用该工艺生产疫苗是不可逆转的趋势。MDCK细胞系(犬肾细胞)已被商业化应用，细胞及培养基来源易得。

基于以上的科学进展，本发明所着重解决的问题是：

1、开发出一种弱毒的新城疫病毒、重组质粒，其需要满足针对于II型、VII型新城疫和IBV的免疫源性。

2、开发一种能够容易实现的重组质粒；

3、针对该重组病毒需要具有高滴度表达的培养措施。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组质粒，该重组质粒采用强毒性的VII亚型NDV毒株DHN3株为基础，用Lasota弱毒株的F基因替换了DHN3株的F基因，插入S1基因，针对II型、VII型新城疫和IBV具有免疫源性。同时，本发明还公开了一种重组病毒以及针对该病毒的高滴度培养方法。

本发明的具体方案如下：一种重组质粒pBR322-FDHN3-S1，其序列如序列表SEQ IDNO：1所示。

同时，本发明还公开了一种如上所述的重组质粒的制备方法，将F1片段、F2片段、F3片段、S1片段同源重组得到重组质粒pBR322-FDHN3-S1；

所述S1片段的序列分别如SEQ ID NO：2所示；

所述F1片段、F2片段的制备方法为：以pBR322-FDHN3载体为模板用分别用引物，FDHN3-F1/FDHN3-SmaI-R1；FDHN3-SmaI-F2/FDHN3-R2扩增长度为1463bp的F1，和长度为4845bp的F2PCR片段；

所述pBR322-FDHN3载体、引物FDHN3-F1、FDHN3-SmaI-R1、FDHN3-SmaI-F2、FDHN3-R2的序列如序列表SEQ ID NO：3～7所示；