[发明专利]一种农杆菌介导的高效玉米骨干自交系遗传转化的方法

说明书

本发明公开了一种农杆菌介导的高效玉米骨干自交系遗传转化的方法，包括以下步骤：步骤1，配置诱导培养基；步骤2，选取外植体取授粉11‑16天的幼雌性穗，并对其进行消毒，消毒时采用酒精浸泡8‑12分钟，消毒完成后选取雌穗中部颗粒饱满大小在1.0‑1.6mm的幼胚；步骤3，将选取的幼胚接种到诱导培养基中，诱导愈伤组织，在黑暗环境培养2‑6天，温度保持在23‑28度之间；本发明所提出的农杆菌介导的高效玉米骨干自交系遗传转化的方法通过降低农杆菌介导转化玉米共培养的时间，可大大的提高玉米愈伤组织的出愈率，愈伤质量，以及愈伤组织的分化能力，并将出苗率提高到65％。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种农杆菌介导的高效玉米骨干自交系遗传转化的方法。

背景技术

玉米是禾本科的一年生草本植物，又名苞谷、苞米棒子、玉蜀黍、珍珠米等，原产于中美洲和南美洲，是世界重要的粮食作物，广泛分布于美国、中国、巴西和其他国家，玉米具有很强的耐旱性、耐寒性、耐贫瘠性以及极好的环境适应性，营养价值较高。作为中国的高产粮食作物，玉米是畜牧业和养殖业的重要饲料来源，也是食品、医疗卫生、化工业等的不可或缺的原料之一。

高效植物转化系统应具备以下几个特点：转化体系稳定；转化效率高；转化方法受基因型限制少，且便于操作；受体组织具有较强的分化和再生能力；上世纪90年代，玉米的转基因研究迅速发展，转基因方法也出现了多样化。植物转基因方法主要分为两大类：一是DNA直接导入转化，包括基因枪转化法、聚乙二醇(PEG)法、电激穿孔法、超声波介导法、碳化硅纤维介导法、花粉管通道法和显微注射法等；二是载体介导转化，如农杆菌法等。基因枪转化法法、农杆菌介导法在玉米转基因上应用的较为成功，目前生产上所推广应用的转化体以及已经发表的科研论文中所使用的转化方法90％以上是由农杆菌和基因枪转化法。

在现有技术玉米骨干自交系遗传转化的方法中，农杆菌介导转化玉米共培养的时间较长，同时还伴随有玉米愈伤组织的出愈率低，愈伤组织质量较差，愈伤分化能力不强，出苗率低于60％等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的高效玉米骨干自交系遗传转化的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种农杆菌介导的高效玉米骨干自交系遗传转化的方法，包括以下步骤：

步骤1，配置诱导培养基；

步骤2，选取外植体取授粉11-16天的幼雌性穗，并对其进行消毒，消毒时采用酒精浸泡8-12分钟，消毒完成后选取雌穗中部颗粒饱满大小在1.0-1.6mm的幼胚；

步骤3，将选取的幼胚接种到诱导培养基中，诱导愈伤组织，在黑暗环境培养2-6天，温度保持在23-28度之间；

步骤4，将所愈伤组织与胚芽分离，然后将愈伤组织接种于农杆菌悬浮液中浸染；

步骤5，将浸染后的愈伤组织从农杆菌悬浮液中取出，利用无菌布擦拭干净，并置于无菌台面晾干；

步骤6，配置共同培养基；

步骤7，将晾干后的愈伤组织放入共同培养基中，保持温度在20-25度，光照12-14h/d，光照强度在6000-10000lx直至愈伤组织表面出现菌体即可；

步骤8，再次对愈伤组织进行清洗，清洗后将表面擦拭干净后，并置于无菌台面晾干；

步骤9，配置筛选培养基；

步骤10，将愈伤组织接种到筛选培养基中进行抗性筛选，获取抗性的愈伤组织；

步骤11，配置分化培养基；

步骤12，将抗性愈伤组织接种到分化培养基培养，直至愈伤组织生出幼苗；