[发明专利]一种人造新冠病毒吞噬细胞的方法

权利要求书

1.一种人造新冠病毒吞噬细胞的方法，其特征在于，以DNA重组将产前诊断后废弃的羊水间充质干细胞改造为能向新冠病毒感染部位迁移定居、能将新冠病毒吸入干细胞内、能沉默新冠病毒mRNA在干细胞内转录、能在体外永生传代的兼具干细胞天然治疗功能并获得吞噬细胞趋化、吞噬和杀毒功能的人造新冠病毒吞噬细胞，使之在新冠肺炎治疗中能集中到感染部位，然后分化为既是肺组织细胞又是吞噬细胞的多功能细胞。

2.根据权利要求1所述的一种人造新冠病毒吞噬细胞的方法，其特征在于，所述永生传代是指将永生化基因SV40LT整合至羊水间充质干细胞DNA，使之在保持干细胞天然功能的基础上转化为能永久生存、无限扩增、在-196℃液氮中长期冻存的干细胞系MSC-SV40LT。

3.根据权利要求1所述的一种人造新冠病毒吞噬细胞的方法，其特征在于，所述迁移或者趋化是指将AT2R基因整合至干细胞系的DNA，构建在保持MSC-SV40LT功能的基础上因过表达AT2R而易向血管紧张素II上调的炎症部位迁移的过表达AT2R干细胞系MSC-AT2R。

4.根据权利要求1所述的一种人造新冠病毒吞噬细胞的方法，其特征在于，所述吸入或者吞噬病毒是指将作为新冠病毒受体的血管紧张素转换酶II即ACE2基因整合至MSC-AT2R的DNA，构建在保持MSC-AT2R功能的基础上因过表达ACE2而能将新冠病毒吸入干细胞内的ACE2过表达永生化干细胞系MSC-AT2R/ACE2。

5.根据权利要求1所述的一种人造新冠病毒吞噬细胞的方法，其特征在于，所述基因沉默或者杀毒是指将新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰序列shRNA整合至MSC-AT2R/ACE2的DNA，构建在保持MSC-AT2R/ACE2功能的基础上因过表达shRNA而能降解干细胞内新冠病毒mRNA从而抑制新冠病毒复制的shRNA过表达永生化干细胞系MSC-AT2R/ACE2/shRNA。

6.根据权利要求1-5任一所述的一种人造新冠病毒吞噬细胞的方法，其特征在于，包括在MSC-SV40LT的DNA上整合AT2R、ACE2和/或shRNA构建相应的过表达干细胞系。

7.根据权利要求1、6所述的一种人造新冠病毒吞噬细胞的方法，其特征在于，通过慢病毒表达载体的构建、慢病毒包装、慢病毒转染将AT2R、ACE2和/或shRNA整合到DNA。

8.根据权利要求1、7所述的一种人造新冠病毒吞噬细胞的方法，其特征在于，所述慢病毒载体包括pHBLV-CMV-IRES-ZsGreen、pHBLV-CMV-EF1-RFP、pHBLV-CMVIE-RFP-T2A-Puro、pHBLV-CMV-IRES-Puro、pHBLV-IRES-ZsGreen-PGK-puro、pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-Puro、pHBLV-U6-ZSGreen、pHBLV-CMVIE-Luc-T2A-Puro、pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-Luc、pGC-FU、pHBLV-U6-ZSGreen-puro、pHBLV-U6-Puro、pHBAd-U6-CMV、pHBLV-U6-ZsGreen-T2A-Puro、pHBLV-U6-RFP-T2A-luc、pHBLV-U6-RFP-T2A-Puro、pHBLV-U6-ZsGreen-T2A-Luc、pHBLV-U6-RFP pHBLV-U6-Luc-T2A-Puro。

9.根据权利要求1、5所述的一种人造新冠病毒吞噬细胞的方法，其特征在于，所述新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰序列shRNA序列见“NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列表”。

10.根据权利要求1所述的一种人造新冠病毒吞噬细胞的方法，其特征在于，按以下实验方法操作，包括将之用作疫苗载体制备新冠病毒疫苗的步骤：

(1)采集产前诊断后剩余羊水细胞，分离羊水成纤维细胞，转染SV40LT基因，以G418筛选永生化羊水细胞系，经细胞系生物学特性鉴定和干细胞标志物检测，获得永生化羊水间充质干细胞系MSC-SV40LT。

(2)扩增AT2R基因，扩增产物经纯化和酶切后与慢病毒表达载体GV358连接，构建表达AT2R的重组载体GV358-OE-AT2R，经转化、PCR和测序鉴定后，与包装质粒共转染293T细胞，包装携带AT2R的重组慢病毒，然后转染干细胞系MSC-SV40LT，使AT2R基因整合到干细胞DNA上，用嘌呤霉素筛选，获得过表达AT2R的干细胞MSC-AT2R。

(3)扩增ACE2基因，扩增产物经纯化和酶切后与慢病毒表达载体连接，构建表达ACE2的重组慢病毒表达载体pHBLV-OE-ACE2或pGC-FU-ACE2，经转化、PCR和测序鉴定后，与包装质粒共转染293T细胞，包装携带ACE2的重组慢病毒，然后转染MSC-AT2R，使ACE2整合到干细胞DNA上，用嘌呤霉素筛选，获得同时表达AT2R和ACE2的干细胞MSC-AT2R/ACE2。

(4)设计和优选新冠病毒靶向干扰序列siRNA，合成模板shRNA，连接载体pHBLV或LV3，构建重组慢病毒载体pHBLV-shRNA或LV3-shRNA，经转化、PCR和测序鉴定后，与包装质粒共转染293T细胞，包装携带shRNA的慢病毒，然后转染MSC-AT2R/ACE2，使shRNA整合到干细胞DNA上，获得同时表达AT2R、ACE2和shRNA的干细胞MSC-AT2R/ACE2/shRNA。

(5)RT-PCR和Western-Blot检测AT2R、ACE2和shRNA表达，并验证功效，选择既保留干细胞的天然功能又获得吞噬细胞的趋化、吞噬和杀毒功能的新冠病毒吞噬细胞，收藏于COVID-19防控干细胞库，临用时复苏、培养、个体化同型选用。

(6)根据GenBank分析SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列，以氨基酸密码子同义置换合成RBD肽段对应核酸的全基因，以合成的RBD基因构建重组质粒pHBLV-RBD或pGC-FU-RBD，分别包装慢病毒并转染MSC-SV40LT、MSC-AT2R、MSC-AT2R/ACE2和/或MSC-AT2R/ACE2/shRNA，使RBD基因整合到DNA上，获得通过表达RBD基因产生相应抗体的新冠疫苗，收藏于COVID-19防控干细胞库，临用时复苏、培养、个体化同型选用。