[发明专利]用于甲基化核酸的高深度测序的方法和系统

说明书

本文中提供的方法和系统通过改进核酸甲基化测序的质量和准确度及其检测疾病的用途而解决了目前基于亚硫酸氢盐的甲基化测序的局限性。包括用于甲基化测序的破坏性最小的转化方法以及特化UMI衔接子的方法提供了改进的测序文库和测序信息的质量。更高的准确度和更全面的甲基化状态信息允许产生更高质量的特征以供用于产生机器学习模型和分类器。

交叉引用

本申请要求2019年5月31日提交的美国临时申请62/855,795号的权益，该临时申请通过援引而整体地并入本文中。

援引并入

在包括实施例的本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过援引而整体地并入本文中，如同每一篇出版物、专利或专利申请被明确且单独地表明通过援引并入。在矛盾的情况下，以包括本文中的任何定义的本申请为准。

背景技术

由于DNA的稳定性以及DNA在正常分化和疾病例如癌症中的作用，DNA甲基化可以体现肿瘤特征和表型状态，并且因此有较高的潜力用于个性化药物。异常的DNA甲基化模式发生在癌症的发病机制早期，并且因此可以促进早期癌症检测。实际上，DNA甲基化异常是癌症的标志之一并且与癌症(从肿瘤启动至癌症进展和转移)的所有方面相关联。这些性质启发了将DNA甲基化模式用于癌症诊断的多种新方法。具体而言，无细胞DNA(cfDNA)是循环中存在的片段化DNA，并且片段化模式作为生物信号是有用的并且提供信息。相比之下，基因组DNA在体外被人工片段化用于文库制备，因此基因组DNA的片段化模式对于诊断方法而言并非如此重要。

DNA甲基化是对DNA的共价修饰并且是稳定的遗传性标志，其可以在抑制基因表达和调节染色质结构方面发挥重要作用。在人类中，DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基处。不同于其他二核苷酸，CpG不均匀地分布在整个基因组并且可以集中在称为CpG岛的短CpG富集DNA区。一般而言，在基因组中大多数CpG位点被约70-75％甲基化。然而，甲基化模式随着细胞类型而不同，反映了它们在调节细胞类型特异性基因表达中的作用。以此方式，细胞的甲基化组可以将该细胞的终末分化状态程序化为例如神经元、肌肉细胞、免疫细胞等。

此外，组织中的各种细胞亚型可以表现出不同的甲基化模式。在癌细胞中，CpG甲基化可能失调，并且甲基化模式的异常是肿瘤发生中存在的一些最早期事件。在给定的癌症类型中的甲基化图谱非常类似于癌症起源组织的甲基化图谱。因此，在cfDNA片段上异常的甲基化标志可以用于区分正常细胞与癌细胞，并且确定组织类型起源。一般而言，癌细胞中的整体CpG甲基化水平下降，但是在特定的基因座处，特定CpG位点的平均甲基化水平(或甲基化％)可以在癌细胞中和对应的正常细胞中有所不同。在正常细胞与病变细胞之间对甲基化的CpG(DMC；单个位点)或区域(DMR；局部区域中多于一个位点)进行区别性地图谱分析允许鉴定疾病的生物标志物。这种方法引导了SEPT9基因甲基化检测(Epi proColon)的开发，这是首个FDA批准的对结肠直肠癌(CRC)基于血液的诊断。

亚硫酸氢盐转化或亚硫酸氢盐测序已变成DNA甲基化分析的广泛使用的方法。亚硫酸氢盐测序是将DNA甲基化定位到单个碱基的方便且有效的方法。遗憾地，亚硫酸氢盐转化对cfDNA而言是严苛且破坏性的过程，其导致样品DNA的90％降解。构建亚硫酸氢盐测序文库的两种主要方法是：(1)在文库构建之前对DNA进行亚硫酸氢盐转化，其需要建立单链DNA文库；和(2)在双链衔接子连接之后对DNA进行亚硫酸氢盐转化。这两种情况中的任一种都涉及DNA的严重降解，这可能是有问题的，特别是对于cfDNA而言，因为cfDNA以非常低浓度存在于血浆中并且是液体活检应用中的限制性资源。在ssDNA文库中，一些降解的cfDNA可以被保留在文库中，但是降解的片段上的端点信息丢失。这种文库限制了使用cfDNA端点或片段长度信息来研究DNA甲基化的能力。在dsDNA文库中，由亚硫酸氢盐切割的cfDNA插入片段从文库丢失，但是对于留存的cfDNA插入片段，端点信息得以保留。这需要过大的血液采集体积才能实现对基因组的高深度唯一性覆盖，或者局限于仅仅以低深度唯一性覆盖进行分析。