[发明专利]用于基于LC-MS的HbA1c测量的高速样品工作流程

说明书

本发明涉及通过质谱(MS)测定糖化血红蛋白A(HbA1c)分子的肽片段的方法、试剂盒和适于执行所述方法的临床诊断系统。

技术领域

本发明涉及通过质谱(MS)测定糖化血红蛋白A(HbA1c)分子的肽片段的方法、试剂盒和适于执行该方法的临床诊断系统。

背景技术

循环血糖水平的控制受损是糖尿病的一个指标。血糖可以在非酶促统计过程中连接到多肽的赖氨酸残基上，从而导致糖化多肽。在血红蛋白A(HbA)的情况下，葡萄糖与β链的N末端发生反应。得到的糖化血红蛋白Aβ链被指定为HbA1c。

HbA1c是人类血液中主要的糖化血红蛋白种类。综合糖尿病控制和并发症试验(DCCT)提供的证据表明，诸如视网膜病、肾病和神经病的并发症与胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)患者的高血糖程度直接相关，并表明血液中的HbA1c的测量是长期监测糖尿病患者血糖状态的绝佳工具(Nathan等人，N.Engl.J.Med 329(1993)977-986；Santiago，J.V.，Diabetes 42(1993)1549-1554；Benjamin，J.和Sacks，D.B.，Clin.Chem.40(1994)683-687；和Goldstein D.等人，Clin.Chem 40(1994)1637-1640)。DCCT研究还清楚地表明，需要分别对HbA1c和HbA0(非糖化血红蛋白)进行可靠且可重复的测量。

有许多不同的测定糖化血红蛋白的方法，即物理化学方法，包括色谱和/或质谱(MS)、化学方法和免疫学方法。国际临床化学和实验室医学联合会(IFCC)批准的测量人血中HbA1c的参考方法包括通过酶胞内蛋白酶Glu-C将血红蛋白酶促切割为肽18-20h，然后通过HPLC和电喷雾电离质谱或在二维方法中使用HPLC和毛细管电泳结合UV检测来分离和定量β链的糖化和非糖化N末端六肽(Jeppsson等人，Clin.Chem.Lab.Med.40(2002)，78-89)。

Kaiser等人已经描述了对该参考方法的修改(Clin.Chem.54(2008)，1018-1022；Li等人，J.Chromatogr.B.776(2002)，149-160；Jeong(MassSpectrom.Lett.5(2014)，52-56；和Zhang等人，Clin.Chem.Lab Med.54(2016)，569-576)，均指蛋白水解消化至少18h。

因此，涉及血红蛋白A酶消化的已知方法通常需要过夜孵育以获得足够量的切割产物并因此获得稳定的测量信号。此外，在对样品进行MS检测之前，需要使用常规色谱分离包含基质成分的复杂肽混合物。因此，这些方法非常耗时，并且对于患者样品的高通量测量用途有限。

因此，需要提供一种通过MS测定HbA1c的快速可靠的方法。

发明内容

本发明的第一方面涉及一种用于测定样品中糖化血红蛋白A(HbA1c)的方法，其包括：

(a)提供包含血红蛋白A(HbA)分子的样品，

(b)对来自步骤(a)的样品进行部分蛋白水解消化步骤，其中产生血红蛋白Aβ链分子的N末端片段，

(c)任选地富集在步骤(b)中产生的血红蛋白Aβ链分子的N末端片段，以及

(d)通过质谱(MS)对包含血红蛋白Aβ链分子的N末端片段的样品进行分析，其中测定样品中HbA1c的量或浓度。

本发明的第二方面涉及一种试剂盒，其包含

(i)用于HbAβ链分子的部分蛋白水解消化的酶和任选地用于所述酶的消化缓冲液，

(ii)能够停止用(i)的酶进行的蛋白水解消化的停止介质，和

(iii)任选地用于富集蛋白水解消化的HbA1c分子的富集装置，和