[发明专利]杂合体靶向和全转录物组扩增

说明书

本文的公开内容包括用于标记核酸靶的系统、方法、组合物和试剂盒。在一些实施方案中，该方法包括在文库制备(例如，杂合体文库制备)期间使用靶特异性引物和靶非特异性引物。在一些实施方案中，该方法在cDNA文库制备和/或测序文库制备期间增加了选择的低丰度靶的丰度。

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2019年2月14日提交的美国临时专利申请系列第62/805,956号的权益，该相关申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。

背景

领域

本公开内容总体上涉及分子生物学领域，例如使用分子条形码化(molecularbarcoding)确定基因表达。

对现有技术的描述

当前的技术允许在每个细胞与隔室(compartment)中的条形码化试剂珠共定位时通过将细胞特异性寡核苷酸条形码附接到来自个体细胞的多(A)mRNA分子而以大规模平行的方式(例如，10000个细胞)测量单细胞的基因表达。然而，细胞中的核酸通常处于范围为几个数量级的宽浓度范围内。这大大增加了对样品进行全面评估必需的测序或筛选的量。对在文库制备期间增加低丰度核酸丰度的系统和方法存在需求。

概述

本文的公开内容包括对核酸靶进行标记的方法。在一些实施方案中，该方法包括：使多于一种核酸靶与多于一种寡核苷酸杂交，每种寡核苷酸包含第一通用序列和条形码序列；使与多于一种核酸靶杂交的多于一种寡核苷酸延伸，以产生多于一种第一链条形码化多核苷酸；以及使用多于一种第一链条形码化多核苷酸作为模板合成多于一种第二链条形码化多核苷酸，以产生多于一种双链条形码化多核苷酸。该方法可以包括将衔接子的序列添加(例如，将衔接子连接)到多于一种双链条形码化多核苷酸，其中衔接子包含第二通用序列。该方法可以包括使用能够与第一通用序列和第二通用序列杂交的引物扩增多于一种双链条形码化多核苷酸，从而产生包含核酸靶、第一通用序列、第二通用序列、其互补序列和/或其一部分的序列的第一多于一种条形码化扩增子，和使用能够与多于一种核酸靶中的两种或更多种杂交的引物扩增多于一种双链条形码化多核苷酸，从而产生包含多于一种核酸靶中的两种或更多种、第一通用序列、第二通用序列、其互补序列和/或其一部分的序列的第二多于一种条形码化扩增子。

在一些实施方案中，该方法包括使用随机引物和第一多于一种条形码化扩增子和/或第二多于一种条形码化扩增子或其产物作为模板进行随机引发和延伸。在一些实施方案中，进行随机引发和延伸包括将测序衔接子的序列添加到第一多于一种条形码化扩增子和第二多于一种条形码化扩增子或其产物。在一些实施方案中，该方法包括使用靶特异性引物和第一多于一种条形码化扩增子和/或第二多于一种条形码化扩增子或其产物作为模板进行延伸和/或扩增。在一些实施方案中，进行延伸和/或扩增包括将测序衔接子的序列添加到第一多于一种条形码化扩增子和/或第二多于一种条形码化扩增子。在一些实施方案中，所述测序衔接子包含测序引物(例如，Illumina读段1和读段2序列)或测序衔接子(例如，Illumina P5和P7序列)、其互补序列或其一部分的结合位点。