[发明专利]用于控制蛋白质功能的融合构建体

说明书

本文描述了包含与感兴趣的多肽融合的变体蛋白酶(例如，HCV NS3蛋白酶)和同源蛋白酶切割位点的工程化融合蛋白。所述同源蛋白酶切割位点的可切割性赋予所述感兴趣的多肽的一种或多种功能的可控性。另外公开了产生工程化融合蛋白的方法及其治疗用途。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年1月25日提交的美国临时申请第62/797,043号的权益和优先权，出于所有目的通过引用将其完整并入本文。

序列表

本申请含有已经以电子方式以ASCII格式提交并且通过引用完整并入本文的序列表。创建于2020年1月17日的所述ASCII副本被命名为STB-015WO_SL.txt，并且大小为83,131个字节。

技术领域

本公开总体上涉及蛋白质工程化和控制蛋白质功能方法的领域。具体而言，本公开涉及工程化融合蛋白，其包含与感兴趣的多肽融合的变体蛋白酶(例如，HCV NS3蛋白酶)和同源蛋白酶切割位点，所述同源蛋白酶切割位点的切割可以被蛋白酶抑制剂抑制，使得感兴趣的多肽的一种或多种功能是可控的。

背景技术

用于快速切断真核生物中特定蛋白质的产生和/或功能的技术作为研究工具和用于基因或细胞疗法应用具有广泛用途，但尚未开发出简单且有效的方法。

由于现有的mRNA分子在转录抑制之后继续被翻译成蛋白质，通过阻遏转录来控制蛋白质产生是起始缓慢的。RNA干扰(RNAi)直接诱导mRNA破坏，但RNAi通常仅部分有效，并且可以表现出非序列依赖性和序列依赖性的脱靶效应(Sigoillot等人(2011)ACS ChemBiol 6:47-60)。而且，由于特定mRNA翻译速率的调节，mRNA和蛋白质丰度并不总是相关的(Vogel等人(2012)Nat Rev Genet 13:227-232；Wu等人(2013)Nature 499:79-82；Battle等人(2015)Science 347:664-667)。最后，转录阻遏和RNAi两者的逆转都要花费数天(Liu等人(2008)J Gene Med 10:583-592；Matsukura等人(2003)Nucleic Acids Res 31:e77)。

因而，仍然需要一种简单易用的系统来控制蛋白质产生和功能。

发明内容

为了满足上述需求，本公开涉及融合构建体和使用它们来控制蛋白质功能和/或产生的方法。具体而言，本公开提供了融合蛋白，其包含与感兴趣的多肽融合的变体蛋白酶(例如，HCV NS3蛋白酶)和同源蛋白酶切割位点，所述同源蛋白酶切割位点的切割可以被蛋白酶抑制剂抑制，使得感兴趣的多肽的一种或多种功能是可控的。

因此，本公开的某些方面提供了融合蛋白，其具有感兴趣的多肽；变体丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)蛋白酶；和同源蛋白酶切割位点，其中变体HCV NS3蛋白酶包含一个或多个突变；并且其中当所述融合蛋白在哺乳动物细胞中表达时，所述一个或多个突变降低其免疫原性。在一些实施方案中，HCV NS3蛋白酶衍生自包含与SEQ ID NO:1具有至少约80％-100％序列同一性的氨基酸序列的HCV多蛋白，所述序列同一性包括在这个范围内的任何同一性百分比，比如与SEQ ID NO:1具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，变体NS3蛋白酶衍生自具有氨基酸序列APITAYAQQT RGLLGCIITS LTGRDKNQVEGEVQIVSTAT QTFLATCING VCWAVYHGAG TRTIASPKGP VIQMYTNVDQ DLVGWPAPQG SRSLTPCTCGSSDLYLVTRH ADVIPVRRRG DSRGSLLSPR PISYLKGSSG GPLLCPAGHA VGLFRAAVCT RGVAKAVDFIPVENLETTMR SPVFTD(SEQ ID NO:2)的HCV NS3蛋白酶。