[发明专利]用于对样品中，尤其血液样品中的细胞类型或细胞标志物进行计数的方法

说明书

本发明涉及用于检测样品中特定特征细胞的方法，其包括以下步骤：a)提供细胞悬液1的样品；b)对样品(1)进行第一裂解过程(2)，以使得产生样品(1)的第一裂解物(4)，其中所述裂解如此进行，以使得细胞悬液1的细胞的细胞核保持完好；c)提取在第一裂解物(4)中游离可得的核糖核酸(RNA)；d)将提取的核糖核酸归类，以确定在样品的裂解物中不同类型的核糖核酸的数量；e)对剩余的样品(1)进行第二裂解过程(3)，以使得产生样品(1)的第二裂解物(5)，其中如此进行裂解，以使得样品(1)中的细胞的细胞核被破坏，f)提取在第二裂解物(5)中游离可得的脱氧核糖核酸(DNA)，g)根据脱氧核糖核酸的数量来计算样品中细胞的总细胞数；h)根据在步骤d)中确定的不同类型的核糖核酸的数量和在步骤g)中计算的总细胞数来计算样品中具有各种细胞标志物的细胞的数量。

现有技术

从血液中提取或分离循环肿瘤细胞(CTC)是分析血液以诊断肿瘤细胞的重要步骤。CTC被定义为细胞角蛋白阳性、CD45阴性、具有核(DAPI检测)且源于上皮的细胞。该定义是规定并且在液体活检团体中是基本上被接受的。具有这些性质的细胞应被提取或分离。

角蛋白(来自希腊语κέρα kéras “角质”，第二格kératos)是由动物形成并且表征角质物质和承担细胞内机械功能的各种不溶于水的纤维蛋白的总称。

根据它们作为α螺旋或β折叠的分子结构，人们区分α角蛋白和β角蛋白。角蛋白是哺乳动物毛发、手指甲和脚指甲等的主要成分。α角蛋白(或细胞角蛋白)以松散组织的角蛋白丝的形式存在。细胞角蛋白（CK或根据更新命名法也简称为角蛋白)是中间丝，其形成提供机械支撑并在细胞中实现多种附加功能的蛋白。它们是细胞骨架的一部分和中间丝蛋白的最大家族。区分形成异质二聚体的两种类型的细胞角蛋白，即酸性I型(细胞角蛋白9-23)和碱性II型(细胞角蛋白1-8)。

细胞角蛋白是诊断病理学中的典型标志物，其特别是用于肿瘤识别。给定癌中的原发肿瘤和转移具有细胞角蛋白的相同模式，该模式与其它癌类型不同，由此能够区分不同的肿瘤。

CD45是尤其可用于识别白细胞(白血细胞)的抗原。

抗原是抗体和特定淋巴细胞受体可特异性结合的物质(其中特定淋巴细胞受体也可导致产生针对抗原的抗体)。抗原大多是蛋白，但也可以是碳水化合物、脂质或其它物质。它们可以被B细胞受体、T细胞受体或(由B细胞产生的)抗体识别或结合。

如果细胞来自上皮组织，则该细胞是源于上皮的。上皮组织是特殊的组织类型，其用作被覆组织和腺体组织的总称。上皮组织是覆盖多细胞有机体的所有内部和外部躯体表面的单层或多层细胞层。这里的一个例外是运动系统的关节囊和粘液囊。除了肌肉组织、神经组织和结缔组织之外，上皮组织是多细胞有机体中的四种基本组织类型之一。

核(DAPI检测)是一种检测，即这些细胞具有细胞核——因此不是无细胞核的细胞，例如红血细胞。原则上认为无细胞核的细胞不是CTC，即使如果它们满足所提到的其它标准。术语“裂解”是指细胞悬液中存在的细胞或细胞的细胞膜被破坏，以使得细胞悬液的细胞的各个成分在溶液中是游离可得的。这使得能够稍后分析。

CTC计数的目的是可以在医学研究中在总存活率(OS)和治疗后测量的CTC数量之间建立清楚的关系。也就是说，对CTC的纯计数已可以提供关于OS或治疗功效的重要信息。为了获得肿瘤状态的更广泛的图像，CTC研究目前也集中于识别来自CTC的遗传特征。因此，用于对CTC进行自动分类、计数和归类的系统非常重要。

对于CTC的遗传分析，绝对需要确保样品中实际上也存在细胞。否则，在不存在信号(＝不存在遗传特征)的情况下，不清楚是样品中没有CTC还是一般而言没有细胞，例如因为样品被污染并且检测反应因此没有产生信号。

因此，希望获得可对样品的绝对细胞数进行计数的方法。