[发明专利]改善蛋白酶表达的手段和方法

权利要求书

1.一种核酸构建体，该核酸构建体包含：

a)与至少一种编码蛋白酶的多核苷酸可操作地连接的第一异源启动子；以及

b)与至少一种编码折叠酶的多核苷酸可操作地连接的第二异源启动子；

其中该折叠酶与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9具有至少80％的序列同一性。

2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中该第一异源启动子和该第二异源启动子是相同或不同的启动子；优选地，该第一异源启动子和该第二异源启动子是相同启动子的相同拷贝。

3.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该蛋白酶是丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或天冬酰胺肽裂解酶。

4.根据权利要求3所述的核酸构建体，其中该蛋白酶是丝氨酸蛋白酶；优选枯草杆菌酶，最优选枯草杆菌蛋白酶。

5.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该蛋白酶包含C-末端前肽或N-末端前肽和/或N-末端信号肽；或其中该蛋白酶是成熟蛋白酶。

6.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该蛋白酶与SEQ ID NO:3具有至少80％的序列同一性。

7.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该蛋白酶包含SEQ ID NO:3或由SEQ ID NO:3组成。

8.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该蛋白酶是克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(AprH)或其变体。

9.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一种编码蛋白酶的多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％的序列同一性。

10.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一种编码蛋白酶的多核苷酸包含SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1组成。

11.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一种编码折叠酶的多核苷酸与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少80％的序列同一性。

12.根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中该至少一种编码折叠酶的多核苷酸包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7，或由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7组成。

13.一种表达载体，该表达载体包含根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体。

14.一种革兰氏阳性宿主细胞，在该革兰氏阳性宿主细胞基因组中包含根据权利要求1-12中任一项所述的核酸构建体和/或根据权利要求13所述的表达载体。

15.根据权利要求14所述的革兰氏阳性宿主细胞，其中该革兰氏阳性宿主细胞是芽孢杆菌属宿主细胞；优选地，该芽孢杆菌属宿主细胞选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、植物解淀粉芽孢杆菌亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

16.一种用于生产蛋白酶的方法，该方法包括：

a)提供根据权利要求14-15中任一项所述的革兰氏阳性宿主细胞；

b)在有利于该蛋白酶和该折叠酶表达的条件下培养所述革兰氏阳性宿主细胞；以及，任选地

c)回收该蛋白酶。

17.根据权利要求16所述的方法，其中该革兰氏阳性宿主细胞是芽孢杆菌属宿主细胞；优选地，该芽孢杆菌属宿主细胞选自由以下组成的组：嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、植物解淀粉芽孢杆菌亚种、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。