[发明专利]改善蛋白酶表达的手段和方法

说明书

本发明涉及通过与折叠酶共表达来改善蛋白酶表达的手段和方法。

序列表的引用

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技术领域

本发明涉及通过与折叠酶共表达来改善蛋白酶表达的手段和方法。

背景技术

在工业生物技术中，持续需要提高生产产率，从而在酶和其他工业相关蛋白质的生产中提高利润率。一个成功的策略是使用过表达编码靶蛋白的基因的生产宿主细胞，例如通过使用包含几个基因拷贝的多拷贝菌株或通过修改其控制序列来增强基因的活性。为了充分利用基因过表达的有利作用，需要增加生产宿主细胞的分泌能力，以克服分泌机制中的任何瓶颈。

折叠酶是协助其他蛋白质折叠的蛋白质。生产宿主细胞中一种或多种分子折叠酶的过度表达可以使给定的靶蛋白的折叠增强，这反过来又可能导致正确折叠的蛋白质分泌增强，从而提高生产产率。

PrsA是一种胞质外折叠酶，发现存在于包括工业相关的地衣芽孢杆菌在内的多种革兰氏阳性细菌中。PrsA是一种二聚体脂蛋白质，锚定在细胞膜的外小叶(outer leaflet)中，在此处它有助于通过保守的SecA-YEG途径分泌的蛋白质的折叠。

已表明，天然PrsA的过表达可改善革兰氏阳性细菌中多肽的表达(WO 1994/019471)。

我们已观察到，克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(AprH)与某些细菌折叠酶的共表达可显著改善AprH的表达。基于这一发现，我们提出这些特异性折叠酶通常可用于改善蛋白酶的表达。

发明内容

本发明涉及令人惊奇的创造性发现，克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(AprH)和某些细菌折叠酶的共表达提高了AprH表达产率。

在第一方面，本发明涉及核酸构建体，其包含：

a)与至少一种编码蛋白酶的多核苷酸可操作地连接的第一异源启动子；以及

b)与至少一种编码折叠酶的多核苷酸可操作地连接的第二异源启动子；

其中该折叠酶与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9具有至少80％的序列同一性。

在第二方面，本发明涉及表达载体，这些表达载体包含根据第一方面所述的核酸构建体。

在第三方面，本发明涉及革兰氏阳性宿主细胞，这些革兰氏阳性宿主细胞在基因组中包含根据第一方面所述的核酸构建体和/或根据第二方面所述的表达载体。

在第四方面，本发明涉及用于生产蛋白酶的方法，这些方法包括：

a)提供根据第三方面所述的革兰氏阳性宿主细胞；

b)在有利于蛋白酶表达的条件下培养所述宿主细胞；以及，任选地

c)回收该蛋白酶。

附图说明

图1示出了一个系统发生树，描绘了从各种革兰氏阳性物种获得的不同PrsA同源物之间的相互关系。分支长度与氨基酸序列的散度成正比。来自芽孢杆菌属物种(Bacillussp.)的PrsA的序列号为25，与来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的PrsA具有47.7％的序列同一性。来自高温木质素降解菌(Geobacillus caldoxylosilyticus)的PrsA的序列号为26，与来自枯草芽孢杆菌的PrsA具有53.3％的序列同一性。

图2示出了用于在枯草芽孢杆菌菌株AN2中整合prsA基因的线性DNA产物的示意图。

图3示出了用于在枯草芽孢杆菌菌株AN2、AN2406和AN2407中整合aprH基因的线性DNA产物的示意图。

定义