[发明专利]用于检测血浆中DNA病原体的DNA测序文库的制备

说明书

本申请提供了一种用于检测来自人类患者、动物或植物的样本中的病原体的基于不可预知的鸟枪核酸测序的方法。该方法包括将该样本脱宿主掉宿主来源的核酸分子，并且提供用于在事先不了解病原体的基因组序列的情况下进行病原体检测。

继续申请案数据

本申请要求2019年12月4日提交的美国临时申请序列号62/943,459的权益，该美国临时申请以引用方式并入本文。

背景技术

目前，在来自人类患者、动物或植物的样本中的病原体的检测通常是通过基于抗体的方法、聚合酶链反应(PCR)或靶向核酸捕获之后是测序来完成。这些方法中的每一种方法都需要靶向试剂，例如抗体或DNA寡核苷酸，并且因此需要事先了解病原体。因此，这些方法可能无法检测先前未发现的或以其他方式被忽略的病原体。当然，在鉴定出所关注的病原体之后，可开发靶向方法。然而，由于可能需要新的检测试剂，因此任何临床检测或诊断测试都必须由监管机构重新批准，从而增加了使产品上市的成本和时间。

相比之下，在事先不了解病原体的基因组序列的情况下，不可预知的鸟枪核酸测序方法可检测病原体。利用这种不可预知的方法，核酸不是基于病原体的基因组序列进行富集、扩增或靶向的。因为病原体不是根据病原体的序列检测的，所以不同的病原体不需要不同的试剂。因此，对于样本制备和测序方案而言很少或没有监管更新是必需的，从而显著降低了临床产品的成本和上市时间。

通过不可预知的测序检测病原体是挑战性的，因为样本往往含有压倒性量的宿主核酸。由于宿主核酸的丰度，检测的灵敏度相当低。在没有附加富集的情况下，为了克服这种低灵敏度，需要大量测序。由于对样本中来自宿主和病原体两者的所有核酸都进行测序，所以大多数测序试剂不必要地进行对宿主基因组的测序。这种附加序列负担可使许多检测应用不可及。

为了提高检测灵敏度并降低与不可预知的鸟枪测序方法相关联的测序成本，需要改进的从样本中有效去除宿主DNA并因此富集病原体DNA的方法。

发明内容

本发明包括一种样本制备方法，该方法包括获得宿主生物样本，从宿主生物样本中去除完整细胞，以及从宿主生物样本中去除小于1000个碱基对(bp)的核酸分子以获得脱宿主的样本(dehosted sample)。在一些方面中，该方法还包括对脱宿主的样本中剩余的核酸分子进行测序。在一些方面中，该方法包括由脱宿主的样本中剩余的核酸分子制备测序文库，并且在一些方面中进一步对该测序文库的核苷酸序列进行测序。在一些方面中，该方法还包括鉴定经测序的序列内的病原体序列。

本发明包括一种使从宿主生物获得的样本脱宿主的方法，该方法包括从宿主生物样本中去除完整细胞，以及从宿主生物样本中去除小于1000个碱基对(bp)的核苷酸分子以获得脱宿主的样本。在一些方面中，该方法还包括对脱宿主的样本中剩余的核酸分子进行测序。在一些方面中，该方法包括由脱宿主的样本中剩余的核酸分子制备测序文库，并且在一些方面中进一步对该测序文库的核苷酸序列进行测序。在一些方面中，该方法还包括鉴定经测序的序列内的病原体序列。

本发明包括一种鉴定从宿主生物获得的样本中的病原体核苷酸序列的方法，该方法包括从宿主生物样本中去除完整细胞，从宿主生物样本中去除小于1000个碱基对(bp)的核苷酸分子以获得脱宿主的样本，由该脱宿主的样本中剩余的核酸分子制备测序文库，对该测序文库的核苷酸序列进行测序，以及鉴定该经测序的序列内的病原体序列。

在本文所述的方法的一些方面中，测序文库是通过基于转座子的文库制备方法制备的。在一些方面中，基于转座子的文库制备方法包括NEXTERA转座子或基于NEXTERA珠粒的转座子。

在本文所述的方法的一些方面中，测序是通过高通量测序进行的。

在本文所述的方法的一些方面中，从宿主生物样本中去除小于1000个碱基对(bp)的核苷酸分子包括从宿主生物样本中去除小于600bp的核酸分子以获得脱宿主的样本。