[发明专利]通过非抗生素依赖性阳性选择筛选表达多基因转基因的细胞克隆

权利要求书

1.一种用于产生转染的NK-92细胞的克隆群体的方法，该方法包括：

用包含阳性选择标志物和至少一种转基因的多顺反子核酸载体转染NK-92细胞，其中该阳性选择标志物是ER-IL2或ER-IL15；

在不存在IL-2的细胞培养基中培养这些转染的NK-92细胞；

在不存在IL-2的情况下，通过克隆稀释来稀释这些培养的NK-92细胞，以形成多个单独的转染的NK-92克隆；以及

表型和基因组筛选该多个转染的NK-92克隆以选择如下克隆，这些克隆(i)表达该至少一种转基因并且(ii)显示该至少一种转基因的单一、非外显子整合。

2.如权利要求1所述的方法，其中该表型筛选通过流式细胞术和/或ELISA进行。

3.如权利要求1所述的方法，其中该基因组筛选通过全基因组测序和/或基因组步移进行。

4.如权利要求1所述的方法，其中该至少一种转基因选自由以下组成的组：Fc受体、归巢受体、G蛋白偶联受体(GPCR)、趋化因子受体、细胞因子受体、分泌的细胞因子、细胞粘附分子、选择素、整合素、抗原结合蛋白和肿瘤相关抗原。

5.如权利要求4所述的方法，其中该Fc受体是CD16或高亲和力CD16。

6.如权利要求4所述的方法，其中该趋化因子受体选自CCR7、CXCR2、或CXCL14受体，并且该细胞粘附分子选自L-选择素(CD62L)、α4β7整合素、LPAM-1和LFA-1。

7.如权利要求4所述的方法，其中该分泌的细胞因子或细胞因子受体是IL-12、TGF-β阱、TGFβRII分子的细胞外结构域和/或TGF-β受体II胞外域的单链二聚体。

8.如权利要求4所述的方法，其中该抗原结合蛋白结合肿瘤中的选自CTLA-4、PD-1、IDO-1、CD39或CD73的免疫调节蛋白。

9.如权利要求4所述的方法，其中该抗原结合蛋白特异性结合选自CD19、CD20、GD2、HER-2、CD30、EGFR、FAP、CD33、CD123、PD-L1、IGF1R、CSPG4或B7-H4的肿瘤相关抗原。

10.如权利要求4所述的方法，其中该抗原结合蛋白包含嵌合抗原受体(CAR)。

11.如权利要求10所述的方法，其中该CAR是CD19-CAR、PD-L1-CAR、HER2CAR、BMCA-CAR和/或CD33-CAR。

12.如权利要求1所述的方法，其中该核酸载体包含启动子。

13.如权利要求12所述的方法，其中该启动子包含至少一个活化T细胞核因子(NFAT)结合结构域。

14.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括：针对表达的转基因因子的功能对这些克隆进行表征。

15.如权利要求1所述的方法，其中该功能表征包含抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、天然细胞毒性、CAR介导的细胞毒性、倍增时间和/或重组蛋白的分泌。

16.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括针对未改变的内在的、非转基因相关的功能对这些克隆进行表征。

17.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括用至少一种增殖增强因子转染真核细胞的群体。

18.如权利要求17所述的方法，其中该至少一种增殖增强因子选自hTERT、Ras、SV40、Myc、CDK4或其组合。