[发明专利]通过非抗生素依赖性阳性选择筛选表达多基因转基因的细胞克隆

说明书

本发明提供了用于产生来源于单个细胞的经转染的真核细胞的克隆群体的组合物和方法。该方法包括用多顺反子核酸载体转染真核细胞的群体，然后对选择的细胞进行非抗生素选择和表征。该多顺反子核酸载体编码可以是自分泌蛋白、miRNA和/或shRNA的选择元件。

本申请要求2019年12月9日提交的美国临时申请号62/945,512的优先权和权益，其全部内容通过援引并入本文。

技术领域

本发明的领域是在不使用抗生素的情况下用于阳性选择经修饰的真核细胞克隆的方法和细胞组合物。

背景技术

以下描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

用于在真核细胞中表达转基因因子的真核细胞的基因工程可以使用若干种已建立的转染方法(病毒转导、脂质转染、电穿孔等)中的一种进行，所有这些方法都需要选择步骤来分离或富集表达转基因的细胞。选择可以通过若干种方法(例如，抗生素或其他药物抗性、纯化柱或细胞分选)完成，所有这些方法都繁琐、耗时、容易丢失材料或产率明显低于100％的纯度。此外，经工程改造以表达多于一种转基因的细胞通常需要连续轮的转染，其中每一轮都需要适当的选择步骤。另外，经工程改造的细胞最通常需要持续的选择压力，以避免转基因表达的丧失。

用于细胞工程的DNA载体通常包括选择标志物，该选择标志物通常是编码对抗生素(如嘌呤霉素或新霉素)的抗性、对药物(如更昔洛韦)的敏感性、荧光蛋白(如GFP)或小肽序列(如His标签或截短的CD20)的基因，这些小肽序列可通过相应的抗体进行检测或通过亲和层析进行选择。选择标志物在载体内的单独的启动子下表达，或者在荧光蛋白和肽标签的情况下，选择标志物通常表达为与感兴趣的转基因蛋白的融合物。

在简单的真核生物(如酵母)的特定情况下，该选择标志物可以是编码酶的基因，该酶允许生长培养基中存在的营养物的代谢。这允许在培养物中持续的选择压力，但也需要未转导的细胞是该营养物的营养缺陷型突变体。

虽然传统选择方法的缺点在出于研究目的培养的细胞中不一定是关键，但用于治疗用途的转染细胞必须受到严格调控且是稳定的。例如，尽管对细胞有害，且很少产生100％纯的群体，但使用抗生素进行选择是一种广泛使用的方法。此外，通常需要在培养物中持续使用抗生素以防止转基因沉默。此外，如果感兴趣的转基因和抗生素抗性基因处于单独的启动子的控制之下，沉默仍可能发生。对于标记的选择，虽然荧光蛋白允许基于表达强度进行细胞分选，但细胞分选器是昂贵的设备，需要额外的步骤以在分选过程中保持无菌条件，并且治疗量的细胞的选择通常是不切实际的。可能比费用更成问题的是，荧光蛋白标志物不适合在培养物中维持选择压力，并且作为融合蛋白，它们可能会影响感兴趣的转基因蛋白的功能。

关于另外的分选技术，暴露在细胞表面的肽标签、或细胞膜蛋白(如截短的CD20)可与荧光染料标记的抗体组合用于细胞分选，或用于使用亲和层析柱或抗体标记的磁珠进行纯化/富集。然而，虽然后一项的技术可以产生高度富集的细胞群体，但细胞回收率通常很低。此外，使用抗体结合蛋白质进行分选可能会具有触发特定信号传导途径的不想要的副作用。并且最后，使用柱或珠的纯化方案不维持培养物中的选择压力，并且通常必须进行多次才能产生合适的纯的群体。

因此，仍然需要一种用于产生经工程改造的细胞的克隆群体的方法，该方法易于选择和分离以稳定表达所需的一种或多种转基因。

本文中鉴定的所有出版物均通过援引并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体且单独地指示通过援引并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。

发明内容