[发明专利]用于在免疫测定中重复使用半抗原涂覆的探针的方法

说明书

本发明涉及免疫测定方法，所述方法在维持可接受的临床测定性能的同时重复使用半抗原固定化测试探针和试剂在任何地方约3到20次对不同样品中的分析物进行定量。所述方法在每个循环中使用包括针对所述分析物的抗半抗原抗体和捕获抗体的双抗体缀合物溶液。每个反应循环完成之后，将所述测试探针浸渍在pH为约1‑4的酸性溶液中，以洗脱形成在所述探针上的免疫复合物并且使所述半抗原固定化探针再生。半抗原涂覆的固相的稳健性允许利用多种变性试剂以在每个循环之后在不损害半抗原在所述固相上的结合活性的情况下高效洗脱所述免疫复合物。

技术领域

本发明涉及一种免疫测定方法，所述方法重复使用经半抗原固定化测试探针以对不同样品中的分析物定量约3到10次。所述方法在每个循环中使用双抗体缀合物溶液，并且通过在每个反应循环完成之后将测试探针浸渍在pH为约1-4的酸性溶液中来再生半抗原涂覆的测试探针。

背景技术

成本控制是全球医疗保健提供者的主要目标。体外诊断(IVD)也不例外，其中生物标志物在诊断和预后中的临床效用已成为患者管理的标准。免疫测定技术在IVD行业中占很大部分并且正在稳定增长，在美国约为3％/年并且在发展中国家为15-20％/年。在一些情况下，如在诊断心肌梗塞时连续测量心脏标志物，成本可能会限制适当的测试量。

用于降低免疫测定的成本的典型方法需要最小化材料的制造费用、劳动力以及设施开销。

用于再循环免疫试剂的任何方法通常集中于将免疫复合物与如酸性/碱性pH溶液、有机溶剂、离液剂等变性剂解离。所述变性步骤在抗体不再与抗原结合的情况下会改变抗体电荷、水合、氢键合和三级结构。将抗体反向暴露于接近生理pH和离子强度的初始结合条件预期可恢复原始结合活性，然而，很少的抗体可以耐受反复暴露于变性条件而不会不利地影响其结合性质以及因此测定性能的某个方面。

需要在维持临床性能的同时降低免疫测定的成本。

附图说明

图1A和1B描绘了具有经荧光素(F)涂覆的探针、作为捕获抗体(AB)的抗F/抗PCT、作为信号AB的Cy5-抗PCT和pH 2洗脱的缀合物的降钙素原(PCT)测定配置。再循环方案中的初始步骤是“预读”，所述预读测量玻璃探针的固有荧光和从前一个循环保留在探针尖端上的任何残留荧光。在测定结束时从最终读取步骤中减去此信号，以得到免疫特异性荧光信号。pH 2洗脱步骤从探针表面剥离免疫复合物，包含捕获AB。每个循环都具有捕获AB的新鲜涂层，这在维持贯穿多个循环的测定性能方面至关重要。1mm直径的探针具有如此小的表面积，使得捕获AB或信号AB的任何结合消耗仅可忽略量的那些试剂，因此允许其在多个循环中重复使用。经荧光素涂覆的探针可以耐受直到pH 2洗脱并且返回到中性pH的多个循环，从而实现其重复使用。

图2示出了遵循方案A，v1利用图1B中描述的荧光素探针格式进行的PCT测定的数据。

图3示出了经荧光素涂覆的探针格式(图1B)中利用方案A，v1的PCT标准品的数据。

图4示出了再循环测定的与商业IVD仪器(Biomerieux Vidas)具有相关性(R²＝0.95)的PCT临床血清样品的结果。

图5呈现了对另一种免疫测定的心肌肌钙蛋白I(TnI)应用再循环测定(方案A，v2)的结果。格式如图1B，不同之处在于捕获AB是与抗TnI连接的抗F，并且信号AB是Cy5-抗TnI。

图6展示了替代性再循环测定。格式与图1B相同，不同之处在于信号AB是用不同的荧光染料Alexa Fluor 647标记的。

图7含有使用Alexa Fluor 647标记的信号AB(方案A，v3)进行的至多10个循环的不同PCT样品的数据。

图8示出了使用不同半抗原/抗半抗原格式的再循环测定。格式与图1B类似，不同之处在于探针涂覆有洋地黄毒苷，并且捕获AB是抗洋地黄毒苷-抗PCT缀合物。