[发明专利]T细胞基因表达的非病毒修饰

说明书

提供了一种脂质混合组合物，其包含可电离脂质、结构脂质例如DSPC、甾醇和表面活性剂例如聚山梨醇酯80、聚氧乙烯(10)硬脂醚、聚氧乙烯(20)硬脂醚或D‑α‑生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯。脂质混合组合物特别适用于转染难以转染的细胞和维持这些细胞的活力。脂质混合组合物特别适合离体T细胞转染。

对相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年4月15日提交的美国临时申请62/833,993；2019年6月13日提交的62/861,220和2019年10月19日提交的62/923,525的优先权。

背景

(a)领域

所公开的主题一般涉及将核酸递送至活细胞，特别是活T淋巴细胞(T细胞)，同时保持它们的活力。

(b)相关现有技术

为了治疗目的改变基因表达可以通过将脂质纳米颗粒(LNP)中的核酸递送至细胞来实现。外源mRNA有望成为产生体内蛋白质表达的一种手段，并且当由LNP而不是病毒载体递送时，可以避免病毒递送所带来的副作用和安全问题。

嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR)是一种现已批准用于人类的靶向免疫疗法(Kymriah^TMtisagenlecleucel和Yescarta^TM axicabtagene ciloleucel)。该过程使用来自接受治疗的受试者的细胞，选择并富集T细胞，然后使用病毒载体改造这些细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)。细胞返回受试者，导致免疫治疗¹。

尽管CAR治疗取得了成功，但存在以下问题：a)并非所有处理过的T细胞都具有CAR，b)在转染的T细胞上表达的CAR量存在差异，c)接受CAR的患者经常已进行多轮化疗，这意味着更难富集的较少的健康T细胞，并且4)细胞因子释放综合征(CRS)患者的发病率很高(46％或更高)^2,3。CRS患者需要重症监护病房级别的护理，并需要使用强大且昂贵的免疫疗法例如托珠单抗(Actemra^TM)进行治疗。

已经尝试了基于病毒的至T细胞转化，但是其是劳动密集型、昂贵的并且造成制造和监管挑战。载体设计和开发需要时间，因为合适的载体决定了转导的效率。此外，病毒制造方法价格昂贵，因为它们受到高度监管、需要大量设备和劳动密集型(每个患者一个批次)。

基于病毒的转染还带来病毒基因组可能随机插入人类基因组的风险，并且需要患者离开医院以在专门的病毒制造场所收获和处理T细胞。

另一种T细胞转化技术使用电穿孔和环状DNA来修正T细胞蛋白表达。然而，电穿孔的细胞可能需要很长时间才能增殖，这表明T细胞的健康已受到该过程的影响。最近的一项研究表明，与LNP介导的mRNA递送相反，电穿孔后T细胞的存活率为31％¹。“睡美人CART疗法”就是这样一种电穿孔方式，但在2018年被搁置^4,5。

比电穿孔破坏性更小的非病毒方法将推进T细胞介导的免疫疗法治疗，同时保持T细胞活力和受试者健康。

发明概述

根据一个实施方案，提供了一种脂质混合组合物，其包括35-55Mol％的可电离脂质、5-25Mol％的结构脂质、25-40Mol％的甾醇和0.1-3Mol％的表面活性剂。根据另一个实施方案，组合物与核酸混合以形成脂质颗粒。根据另一个实施方案，提供了用于将核酸转染到靶细胞中的脂质混合组合物。根据另一个实施方案，提供了一种脂质混合组合物，其中所述转染在离体发生。