[发明专利]启动子序列和相关产物及其用途

说明书

本披露提供了遍在短启动子元件，其能够在具有医学意义的多种哺乳动物细胞类型中驱动基因表达。本文披露了掺入启动子的表达载体。本文披露了病毒载体，特别是与常规启动子相比可能容纳更大的转基因的AAV载体。本文披露了增强基因表达的方法。

相关申请

本申请要求2019年4月24日提交的美国临时专利申请号62/838,063的优先权，将该申请通过引用以其全文特此并入。

关于联邦政府资助研究的声明

本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的批准号U01 DK089569在政府支持下进行。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本披露总体上涉及生物技术领域，特别涉及启动子序列和相关产物及其用途。

背景技术

在病毒载体中使用最广泛的强遍在(ubiquitous)启动子(CMV、CAG等)是相当大的(约1,000bp)。就可以表达的转基因而言，这可能是受限的。例如，AAV的包装极限(packaging limit)为约4.8kb。减去当前使用的启动子后，单链AAV中的转基因仅留下约3.7kb，而自身互补rAAV仅留下约1.2kb。需要允许表达更大的转基因的启动子。

发明内容

本文提供了遍在小启动子元件，其能够在具有医学意义的多种哺乳动物细胞类型中驱动高产量的基因表达。此外，启动子在人胰腺内分泌细胞(β细胞和α细胞)以及原代人肝细胞中发挥良好作用。它们与极强遍在启动子CMV和CAG的强度相当。

启动子可与质粒和病毒载体一起使用。启动子可允许在单链AAV中插入约4kb转基因以及在自身互补AAV中插入约1.6kb转基因。对于自身互补载体，大小优势特别显著。

附图说明

图1A描绘了分化为β样细胞的人胚胎干(ES)细胞的显微镜图像。上方分图描绘了在示例性INS84启动子下用表达mRFP的AAV-KP1转导的细胞的图像。下方分图描绘了未用AAV转导的细胞。左侧分图显示了ES-β样细胞的明视野显微镜图像，而中间分图描绘了表达指示胰岛素表达的绿色荧光蛋白(GFP)的细胞的图像。右侧分图描绘了红色荧光蛋白(RFP)的图像，其表明INS84启动子的转基因表达。

图1B是测量RFP和C肽(c-pep，一种在成熟β细胞中表达的肽)的FACS分析的图示。

图2描绘了在示例性INS84启动子(左侧分图)或全长胰岛素启动子(右侧分图)下用表达mRFP的AAV转导的源自尸体的原代人胰岛的显微镜图像。上方分图描绘了RFP的落射荧光显微镜图像，而下方分图描绘了明视野显微镜图像。

图3是用示例性AAV-INS84-mRFP转导的人胰岛细胞的FACS分析图。左侧分图是表示测试的总细胞群中RFP表达的图。右侧分图是表示RFP阳性细胞中c-pep和胰高血糖素(gcg)的测量值的图。这表明在α和β细胞中都有转基因表达。

图4是用示例性AAV-INS84-mRFP(左侧分图)或AAV-INSx1-mRFP(右侧分图)转导的原代人胰岛细胞的FACS分析的图示。上方分图是表示侧向散射相对RFP的测量值的图。下方分图显示了细胞群的定量值。

图5描绘了用示例性AAV-INS84-mRFP转导的人胚胎干细胞衍生的β细胞的显微镜图像。由左至右是明视野显微镜图像、GFP绘图和mRFP绘图。

图6是在示例性INS84启动子(左侧分图)下用表达mRFP的AAV或在CAG启动子(右侧分图)下用表达tdTomato的AAV转导的人肝细胞的荧光显微镜图像。

图7描绘了用示例性AAV-INS84-mRFP转导的人胚胎肾细胞(左侧分图)、小鼠胰岛素瘤细胞(中间分图)和小鼠α细胞(右侧分图)中RFP强度的落射荧光显微镜图像。