[发明专利]双链核酸的原位检测及其相关方法

说明书

本发明提供了用于检测靶双链核酸的方法，包括用于原位杂交测定的方法。本发明还提供了具有检测到的靶双链核酸的固定和透化细胞的样品以及含有此类样品的载玻片。本发明另外提供了用于检测靶双链核酸的试剂盒。

本申请要求2019年3月12日提交的美国临时申请号62/817,449的权益，所述临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。

发明背景

本发明总体上涉及核酸的检测，并且更具体地涉及双链核酸的原位检测。

DNA原位杂交(ISH)是广泛用于检测染色体、细胞或组织中的特定序列、同时保留染色体、细胞和组织背景的分子生物学技术(Ratan等人,Cureus 9(6):e1325.doi:10.7759/cureus.1325(2017))。它在研究和诊断方面具有许多应用(Hu等人,Biomark.Res.2(1):3.doi:10.1186/2050-7771-2-3(2014)；Ratan等人,同上,2017；Weier等人,Expert Rev.Mol.Diagn.2(2):109-119(2002))。然而，当前的DNA ISH方法只能检测大染色体区域(100kb)，因为它们使用大探针并且对较短序列的敏感性有限。由于人基因组中的中值基因大小仅为24千碱基，这意味着几乎所有当前的DNA ISH探针都跨越多于一个基因，这通常很难在单基因水平上得出结论。因此，允许对较短序列进行可视化的更灵敏和更具体的方法仍然是技术挑战。

因此，需要用于双链核酸，尤其是较小区域和或单个基因的原位检测方法。本发明满足了这种需要并且也提供了相关的优点。

发明内容

本发明提供了检测双链核酸的方法。在一个实施方案中，本发明提供了一种检测双链核酸的方法，所述方法包括(A)使包含含有一种或多种双链核酸的细胞的样品与靶探针组接触，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(B)使所述样品与前置扩增子接触，所述前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于扩增子的多个结合位点；(C)使所述样品与多个扩增子接触，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点；(D)使所述样品与多个标记探针接触，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点；以及(E)检测与所述靶双链核酸结合的标记探针，从而检测所述靶双链核酸。

在这种方法的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。

在检测双链核酸的这种方法的一个实施方案中，所述双链核酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。

在这种方法的一个实施方案中，所述样品是组织样本或来源于组织样本。在这种方法的另一个实施方案中，所述样品是血液样品或来源于血液样品。在这种方法的另一个实施方案中，所述样品是细胞样品或来源于细胞样品。

在一个实施方案中，本发明提供了一种固定和透化细胞的样品，所述样品包含(A)至少一个含有靶双链核酸的固定和透化细胞；(B)靶探针组，其中所述靶探针组包含一对靶探针，所述一对靶探针包含与靶双链核酸的第一链特异性地杂交的第一探针和与所述双链核酸的第二链特异性地杂交的第二探针；(C)前置扩增子，所述前置扩增子包含用于所述第一靶探针的结合位点、用于所述第二靶探针的结合位点和用于扩增子的多个结合位点，其中所述前置扩增子与所述第一和第二靶探针杂交；(D)多个扩增子，其中所述扩增子包含用于所述前置扩增子的结合位点和用于标记探针的多个结合位点，并且其中所述扩增子与所述前置扩增子杂交；以及(E)多个标记探针，其中所述标记探针包含标记和用于所述扩增子的结合位点，其中所述标记探针与所述扩增子杂交；其中所述杂交在所述靶双链核酸上提供可检测的标记。

在这种样品的一个实施方案中，所述靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性地杂交的靶探针。