[发明专利]用于改进cDNA合成的组合物和方法

权利要求书

1.用于产生具有3'衔接子区域的互补DNA(cDNA)链的方法，该方法包括：

在cDNA合成条件下将RNA模板与cDNA合成引物、模板转换寡核苷酸(TSO)、和逆转录酶结合，其中TSO包括5’衔接子区域和包含至少一个2’-氟核糖核苷酸的3’退火区域，其中：

(i)cDNA合成引物退火至RNA模板且逆转录酶从退火的cDNA合成引物产生RNA-cDNA中间体，其中RNA-cDNA中间体的cDNA链包括3’突出端；以及

(ii)TSO的3’退火区域退火至RNA-cDNA中间体的3’突出端且逆转录酶使用退火的TSO作为模板延伸RNA-cDNA中间体的cDNA链的3’端；

从而产生包含3’衔接子区域的cDNA链。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述3’退火区域包含三个核糖核苷酸残基。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述3’退火区域包含一个2’-氟核糖核苷酸。

4.如权利要求2所述的方法，其中，所述3’退火区域包含两个2’-氟核糖核苷酸。

5.如权利要求2所述的方法，其中，所述3’退火区域包含三个2’-氟核糖核苷酸。

6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，至少一个2’-氟核糖核苷酸是2’-氟核鸟嘌呤(2’fG)。

7.如权利要求6所述的方法，其中，TSO的3’退火区域中的任意的非-2’fG核糖核苷酸是核鸟嘌呤(rG)核糖核苷酸。

8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述3’退火区域包含通用核苷酸碱基。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述通用核苷酸碱基选自：核糖苷(rI)和5’5-硝基吲哚(5’NI)。

10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述3’退火区域包含简并核糖核苷酸碱基(rN)。

11.如权利要求1所述的方法，其中，TSO的3’退火区域，在5’到3’方向上，选自：rG-rG-2’fG；rG-2’fG-2’fG；2’fG-2’fG-2’fG；2’fG-2’fG-2’fG-2’fG；rN-2’fG-2’fG；rI-2’fG-2’fG；和5’NI-2’fG-2’fG。

12.如权利要求11所述的方法，其中，TSO的3’退火区域在5’到3’方向上为：rG-2’fG-2’fG。

13.如权利要求7所述的方法，其中，TSO的3’退火区域在5’到3’方向上为：2’fG-2’fG-2’fG。

14.如权利要求1～13中任一项所述的方法，其进一步包括扩增包括3’衔接子区域的cDNA链。

15.如权利要求1～14中任一项所述的方法，其中TSO的5’衔接子区域进一步包括以下的一个或多个：条形码序列、独特的分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。

16.如权利要求1～15中任一项所述的方法，其中，所述cDNA合成引物包括第二5’衔接子区域和3’RNA退火区域。

17.如权利要求16所述的方法，其中，所述cDNA合成引物的第二5’衔接子区域包括以下的一个或多个：条形码序列、独特的分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。