[发明专利]用于改进cDNA合成的组合物和方法

说明书

本发明提供修饰的模板转换寡核苷酸(TSO)、包含修饰的TSO的组合物、以及使用修饰的TSO自RNA模板合成cDNA的方法，其中cDNA在3’端包含衔接子区域。修饰的TSO在3’退火区域中包含至少一个2’‑氟核糖核苷酸并且与未修饰的TSO相比提供了改进的RNA向全长cDNA的转化，从而提高了产量和复杂性，由此发现了其可用于从RNA输入低的样品产生cDNA。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年提交的名为“用于改进cDNA合成的组合物和方法”的临时专利申请USSN62/845,609的优先权和权益，出于所有目的将其全文以引用方式并入本文。

发明背景

由RNA模板生产全长cDNA对于各种遗传分析都很重要，包括表征基因结构和功能。许多cDNA文库构建方法并非旨在产生全长cDNA产物，通常会缺少RNA模板的5'端。因此，全长RNA模板在许多cDNA文库中的代表性明显不足。改善cDNA文库中全长mRNA表现的一种方法是通过使用模板转换寡核苷酸(TSO)，其充当位于原始RNA模板5'末端附近的合成模板区域，从而允许在cDNA模板3'端添加衔接子区域。这些衔接子区域可用于下游过程，以优先分析全长cDNA种类，例如扩增、衔接子连接和测序。

虽然TSO的使用有利于全长cDNA/cDNA文库的生产，但仍然存在局限性。例如，需要提高由输入水平非常低/有限的RNA样品中生产全长cDNA的产量。本公开的方面解决了这个和其他需要。

发明概述

本公开提供修饰的模板转换寡核苷酸(TSO)、包含修饰的TSO的组合物、以及使用修饰的TSO自RNA模板合成cDNA的方法，其中cDNA在3’端包含衔接子区域。修饰的TSO在3’退火区域中包含至少一个2’-氟核糖核苷酸并且与未修饰的TSO相比提供了改进的RNA向全长cDNA的转化，从而提高了产量和复杂性，由此发现了其可用于从RNA输入低的样品产生cDNA。

本公开的方面包括用于产生具有3'衔接子区域的互补DNA(cDNA)链的方法，该方法包括：在cDNA合成条件下将RNA模板与cDNA合成引物(有时称为逆转录(RT)引物)、模板转换寡核苷酸(TSO)、和逆转录酶结合，其中TSO包括5’衔接子区域和包含至少一个2’-氟核糖核苷酸的3’退火区域，其中(i)cDNA合成引物退火至RNA模板且逆转录酶从退火的cDNA合成引物产生RNA-cDNA中间体，其中RNA-cDNA中间体的cDNA链包括3’突出端；以及(ii)TSO的3’退火区域退火至RNA-cDNA中间体的3’突出端且逆转录酶使用退火的TSO作为模板延伸RNA-cDNA中间体的cDNA链的3’端；从而产生包含3’衔接子区域的cDNA链。

在某些实施方式中，3’退火区域包含核糖核苷酸残基。在某些实施方式中，3’退火区域包含一个2’-氟核糖核苷酸。在某些实施方式中，3’退火区域包含两个2’-氟核糖核苷酸。在某些实施方式中，3’退火区域包含三个2’-氟核糖核苷酸。

在某些实施方式中，至少一个2’-氟核糖核苷酸是2’-氟核鸟嘌呤(2’fG)。在某些实施方式中，TSO的3’退火区域中的任意的非-2’fG核糖核苷酸是核鸟嘌呤(rG)核糖核苷酸。在某些实施方式中，3’退火区域包含通用核苷酸碱基。在某些实施方式中，通用核苷酸碱基选自核糖苷(rI)和5’5-硝基吲哚(5’NI)。在某些实施方式中，3’退火区域包含简并核糖核苷酸碱基(rN)。

在某些实施方式中，TSO的3’退火区域，在5’到3’方向上，选自：rG-rG-2’fG；rG-2’fG-2’fG；2’fG-2’fG-2’fG；2’fG-2’fG-2’fG-2’fG；rN-2’fG-2’fG；rI-2’fG-2’fG；和5’NI-2’fG-2’fG。在某些实施方式中，TSO的3’退火区域，在5’到3’方向，为：rG-2’fG-2’fG。在某些实施方式中，TSO的3’退火区域，在5’到3’方向，为：2’fG-2’fG-2’fG。

在某些实施方式中，所述方法进一步包括扩增包括3’衔接子区域的cDNA链。