[发明专利]具有高比活性的纯化的鱼蛋白酶及其生产方法

权利要求书

1.一种从鱼内脏中纯化鱼蛋白酶的方法，所述蛋白酶具有的平均胰蛋白酶的酶比活性为240U/mg±40U/mg，糜蛋白酶的比活性为4±2U/mg，胶原蛋白酶的比活性为0.04±0.02U/mg，蛋白酶的比活性为65±10U/mg，所述方法包括：

a)用pH7的氯化钙缓冲液从鱼内脏中提取粗酶，过滤和超滤；

b)用电导率52至62mS、pH范围为7.8÷8.2的CaCl₂水溶液提取超滤液，然后进行深度过滤；

c)使用具有直链烷基配体或芳基配体的琼脂糖基质作为固定相，通过滤液的疏水相互作用层析法纯化；和通过用低盐含量的缓冲液洗脱、然后用水溶性有机溶剂和多元醇的水性混合物进行洗脱；

d)透析；

e)可选地冷冻干燥。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述鱼内脏是鳕鱼内脏。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)在4至25℃的温度下进行。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)的钙离子源自终浓度为20mM的氯化钙。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)的超滤使用具有1kDalton截留值的膜进行。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)中使用的固定相的琼脂糖基质呈现芳基配体并且粒度分布在50至100微米之间。

7.根据权利要求1所述的方法，其中使用1.5M乙酸钠水溶液进行在步骤b)中用低盐含量的缓冲液进行的层析洗脱。

8.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤c)的层析洗脱中使用的水溶性有机溶剂是异丙醇。

9.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤c)中用作层析洗脱组分的多元醇是甘油。

10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)在4至25℃的温度下进行。

11.根据权利要求1所述的方法，其中不进行步骤e)，直接从步骤d)中分离所需的最终浓度的鱼蛋白酶水溶液。

12.根据权利要求1-11的方法获得的鱼蛋白酶，其具有的平均胰蛋白酶比活性为240U/mg±40U/mg，糜蛋白酶比活性为4±2U/mg，胶原蛋白酶比活性为0.04±0.02U/mg，蛋白酶比活性为65±10U/mg。

13.制剂，包含权利要求12的鱼蛋白酶、0.1-0.3g/L氯化钾和磷酸二氢钾、7-9g/LNaCl、1.0-1.3g/L磷酸氢二钠、2.4mg/L酚红和最终浓度范围为0.3至0.6mM的乙二胺四乙酸钠。

14.权利要求12的鱼蛋白酶用于食品、生物医学应用、组织学和组织培养中的用途。

15.权利要求12的鱼蛋白酶在PC12和NPC细胞系的组织学和组织培养中的用途。