[发明专利]具有高比活性的纯化的鱼蛋白酶及其生产方法

说明书

本发明涉及从鱼内脏，优选从鳕鱼(Gadus genus)内脏制备鱼蛋白酶的方法。根据本发明生产的鱼蛋白酶具有高的酶比活性，可用于食品用途、生物医学应用、组织学和组织培养。

技术领域

本发明涉及从鱼内脏，优选从鳕鱼(Gadus genus)内脏制备鱼蛋白酶的方法。根据本发明生产的鱼蛋白酶具有高的酶比活性，可用于食品用途、生物医学应用、组织学和组织培养。

背景技术

胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)的蛋白水解活性在1876年被W.Kuhne首次描述于胰腺分泌物中(“das Trypsin(Enzym des Pankreas)”，Verhandlungen desnaturhistorisch-medicinischen Vereins zu Heidelberg,第1卷，第3号，第194-198页)。

这种酶特异性水解赖氨酸和精氨酸氨基酸残基的C-末端肽键，比碱性水解作用快约100倍。自最初发现以来，已在所有动物中鉴定了胰蛋白酶，包括昆虫、鱼和哺乳动物。每种来源的胰蛋白酶的活性略有不同，但该酶的天然底物是任何含有赖氨酸或精氨酸的肽。

人胰蛋白酶水解精氨酸或赖氨酸残基后的肽键，其活性在pH7.5至8.5、以及钙离子存在下最佳；此外，人胰蛋白酶的最佳工作温度约为37℃。

鱼胰蛋白酶，例如从大西洋鳕鱼中分离出来的胰蛋白酶，具有不同的最佳温度范围(因为鱼等变温生物生活在低体温下)。例如，鳕鱼胰蛋白酶包括胰蛋白酶I和胰蛋白酶Y，胰蛋白酶I的最大温度活性范围为4至65℃，在55℃下活性最大，而胰蛋白酶Y的活性范围为2至30C，在21℃下活性最大(Gudmundsdóttir A等人，2005Mar-Apr；7(2):77-88)；HindawiPublishing Corporation；BioMed Research International，Volume 2013，Article ID749078)。哺乳动物胰蛋白酶和鱼胰蛋白酶之间的另一个相关区别是它们的热稳定性：例如，鱼胰蛋白酶而非哺乳动物胰蛋白酶通过巴氏杀菌法完全失活。作为蛋白质，胰蛋白酶根据来源显示出不同的分子量。例如，据报道，来自牛和猪的胰蛋白酶的分子量为23.3kDa，而从大西洋鳕鱼中分离的鱼胰蛋白酶I、胰蛋白酶X和胰蛋白酶Y的分子质量分别为23.9kDa、23.9kDa和25.1kDa(Bjarki Stefansson等人，Characterization of cold-adaptedAtlantic cod(Gadus morhua)trypsin I-Kinetic parameters，autolysis and thermalstability；Comparative Biochemistry and Physiology，Part B；(2010)186–194)。胰蛋白酶的商业应用可包括，尤其是，它们在开发细胞和组织培养方案中的用途(SoleimaniM.；Nadri S.A，Nature protocols(2009)，4(1)，102-6)、在通过肽测序技术进行蛋白鉴定中的用途(Schuchert-Shi等人，Analytical Biochemistry(2009)，387(2)，202-207)、和在医学领域模拟骨关节炎中关节软骨分解中的用途(Wang S.等人，Connective tissueresearch(2010)，51(1)，36-47)。特别是，已经证明鱼胰蛋白酶(大西洋鳕鱼胰蛋白酶I)在各种工业应用中的用途(Bjarnason，J.B.等人，Psychrophilic proteinases fromAtlantic cod ACS Symposium Series(1993)，516(Biocatalyst Design for Stabilityand Specificity)，68-82)，包括从龙虾、虾、蟹和其他海鲜中生产全天然海鲜风味。最近，鳕鱼胰蛋白酶显示高效力的降解天然蛋白和体外抗HSV-1和RSV的抗病原体效力，为鱼蛋白酶的新治疗用途开辟了新的前景(BioMed Research International Volume 2013，Article ID 749078，http://dx.doi.org/10.1155/2013/749078)。蛋白酶以及海洋胰蛋白酶的使用的一个关键方面是它们的稳定性，因为它们会发生自溶。出于这个原因，胰蛋白酶应该储存在非常低的温度(-20至-80℃之间)以防止降解。可以通过将这些蛋白酶保持在pH3或使用通过使用还原性甲基化修饰的蛋白酶来控制自溶。丝氨酸蛋白酶(一类蛋白酶，也包括胰蛋白酶)在将pH调整回8时显示恢复的活性(F.M.Pohl European J.Biochem.7(1968)，146-152；Aizawa，N.；Yokohama Medical Bulletin(1960)，11，101-10)，尽管描述了在非常碱性的条件(pH 10)下工作时重要的活性损失(B.K.Khangembam等人，International Aquatic Research，December 2012，4:9)。从甲壳类动物的肠道中提取并由CAS注册号534583-22-7(商品名Accutase)标识的市售海洋蛋白酶也对温度敏感：它们在4℃下稳定60天，但在37℃下储存时，其很快失去75％的酶活性(90分钟内)。