[发明专利]使宿主细胞产生的非分解代谢化合物的收率和生产率解偶联的方法

说明书

本发明提供了用于使宿主细胞中产生的类异戊二烯化合物的收率和生产率解偶联的组合物和方法。在一些实施例中，收率和生产率通过遗传修饰宿主细胞以减少通过柠檬酸循环(TCA)的通量来解偶联。在其他实施例中，收率和生产率通过降低宿主细胞中的ATP水平来解偶联。

背景技术

收率(yield)和生产率(productivity)是任意生物制造过程的两个主要成本动因。对于类异戊二烯(isoprenoid)等非分解代谢化合物(non-catabolic compound)的生物制造，生产率和收率通常是其他与细胞有关的速率的函数，例如，糖和/或氧消耗速率。以最低成本生产实现生产率与收率的最佳组合的发酵工艺设计需要密切表征这种关系。对于类异戊二烯的生产，在标准发酵条件下，收率始终与细胞特异性氧气和糖摄取速率以及生产率呈负相关，即产生类异戊二烯的细胞摄取氧气和糖的速度越快，类异戊二烯的收率就越低。这种关系被称为“速率-收率耦联(rate-yield coupling)”。收率和生产率的这种反向耦联是有问题的，因为收率和生产率是类异戊二烯生产中的两个关键成本动因。由于速率-收率耦联，任何通过提高氧气和/或糖转移速率来提高生产率的尝试都会导致收率随之降低，从而抵消生产率提高的成本效益。消除收率与生产率之间的逆相关将是有益的，因为可以同时实现高收率和高生产率，从而使类异戊二烯生产的效率最大化(每发酵成本产生的类异戊二烯产品最大化)。

发明内容

本发明总体上涉及在产生非分解代谢化合物的宿主细胞发酵期间非分解代谢化合物的产生过程中解除收率与生产率之间的偶联关系的方法。

在一方面，本发明提供使能够制造非分解代谢化合物的宿主细胞中产生的非分解代谢化合物的收率和生产率之间的偶联关系解除的方法，该方法包括在发酵过程中降低ATP利用率的步骤。

在一实施例中，通过添加一种或多种ATP消耗剂来减少ATP利用。在另一实施例中，一种或多种ATP消耗剂是弱有机酸。在某些实施例中，弱有机酸选自山梨酸、乙酸、苯甲酸和丙酸。在一优选的实施例中，弱有机酸是苯甲酸。

在本发明的其他实施例中，ATP利用通过一种或多种ATP耗散酶的过表达降低。在一实施例中，一种或多种ATP耗散酶选自酿酒酵母SSB1和ATP-二磷酸水解酶(ATP-diphosphohydrolase)。在另一实施例中，ATP利用通过一种或多种ATP解偶联酶的过表达降低。在特定实施例中，一种或多种ATP解偶联酶选自NADH氧化酶(NOX)和交替氧化酶(AOX)。

在本发明的进一步实施例中，ATP水平通过宿主细胞中无效循环(futile cycle)的表达降低。在某些实施例中，无效循环选自磷酸果糖激酶(phosphofructokinase)和果糖-1,6-二磷酸酶(fructose-1,6-bisphosphatase)的同时过表达以及磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase)和丙酮酸羧化酶的同时过表达。

在本发明方法的一实施例中，非分解代谢化合物选自氨基酸、脂肪酸、类异戊二烯和聚酮(polyketide)。在某些实施例中，非分解代谢化合物是类异戊二烯。在特定实施例中，类异戊二烯选自半萜、单萜、二萜、三萜、四萜、倍半萜和多萜。在其他实施例中，类异戊二烯选自松香二烯(abietadiene)、青蒿素前体紫穗槐二烯(amorphadiene)、蒈烯(carene)、α-法呢烯、β-法呢烯、法呢醇、牻牛儿醇(geraniol)、香叶基香叶醇、异戊二烯、芳樟醇、柠檬烯、月桂烯、橙花叔醇(nerolidol)、罗勒烯、广藿香醇(patchoulol)、β-蒎烯、桧烯、γ-萜品烯、萜品油烯和瓦伦烯(valencene)。在一优选实施例中，类异戊二烯是β-法呢烯。

在本发明方法的一实施例中，宿主细胞选自细菌细胞、植物细胞和酵母细胞。在某些实施例中，宿主细胞是酵母细胞。在一优选实施例中，酵母细胞是酿酒酵母。