[发明专利]使用蛋白酶控制限制酶活性

说明书

蛋白酶是一种水解蛋白质并消除其活性的酶。本发明中利用蛋白酶包括蛋白酶K、内切蛋白酶LysC和/或胰蛋白酶的水解活性来控制限制酶的活性和/或消除或减少非必要DNA或RNA片段的产生(称为星号活性)。

背景技术

限制性内切酶也称为限制性核酸内切酶，是水解酶中的一个亚类，能够水解酯键，或者作为DNA或RNA核酸酶切割特定的DNA或RNA序列。在酶消化反应中需要对所有涉及的酶的活性进行优化，从而控制预期产物的纯度或实验结果的准确度。大部分限制性内切酶都会随着时间的延长持续不断地催化底物(DNA或RNA)，进而导致目标DNA或RNA片段不断积累，当然也会伴随副产物的积累。

在优化涉及限制性内切酶的酶反应时，本领域技术人员通常是选用特定的缓冲液，或者调整反应时间，但有时还是会出现副反应等相关问题，特别是当酶除了具有其主要功能的活性外，还具有脱靶活性时，副反应等相关问题更为严重。在优化的限制性核酸内切酶反应中，限制性核酸内切酶通常只在特定时间内消化指定量的底物。但是，随着反应的持续进行，依然会存在一部分限制性核酸内切酶发生副反应、或非目标DNA或RNA的裂解。特别是在特定缓冲体系或甘油含量较高的环境中，当酶的含量过量、反应持续时间过长时，这种现象尤为明显。限制性内切酶在非同源限制位点发生切割活动时所体现的酶活性称为星号活性。

本领域中限制总酶活性从而降低星号活性的常用方法包括：控制酶的浓度或反应时间，例如在反应完成时通过热灭活或其他纯化方法终止反应。但是，这些方法在控制反应的精确度方面还有待提高。本领域亟需探索其他控制反应的方法，以满足精确控制反应进程的需求，达到更高的实验准确度的目的。

总结

蛋白酶是一种水解蛋白质并消除其活性的酶。本申请中利用蛋白酶的水解活性来控制限制性核酸内切酶的活性，以减少或完全消除非目标DNA或RNA片段的产生。

在本申请中，蛋白酶通常直接包含在限制性核酸内切酶的反应混合物中或在反应中间过程中的某个点添加至反应混合物中，从而在DNA/RNA消化反应过程中利用蛋白酶将限制性核酸内切酶灭活。在本申请中的这种控制方式下，反应的总酶活不仅受缓冲液和反应时间的控制，还受底物、限制性内切酶和蛋白酶的相对用量的控制(有时还受到蛋白酶添加时间的控制)。反应过程中可以在所需要的任何时间点添加蛋白酶抑制剂来抑制或停止蛋白酶活性。

以下结合实施例、附图及详细描述对本申请的技术方案做进一步解释。

附图说明

图1：酶BamHI、EcoRI和NcoI在lambda DNA上的理论切割模式，该理论切割模式根据DNA序列以及酶识别和切割的特异性预测而得；该图案可以与图3-8中的任何条带对齐，以用于解释切割或星号活性的完成。

图2：图A：预测的内在限制性核酸内切酶活性，其中，实线：不含蛋白酶的限制性核酸内切酶活性；虚线：含有蛋白酶的限制性核酸内切酶活性。图B：总限制性核酸内切酶活性，其中，实线：不含蛋白酶的总限制性核酸内切酶活性；虚线，含蛋白酶的总限制性核酸内切酶活性。

图3：酶EcoRI在缓冲液A1和A1S2中对lambda DNA的酶活性。图A：在缓冲液A1中1小时的酶活性；图B：在缓冲液A1S2中1小时的酶活性；图C：在缓冲液A1中20小时的酶活性；图D：在缓冲液A1S2中20小时的酶活性。其中，下降三角形(顶部)代表限制性核酸内切酶按照2倍连续稀释。

图4：酶EcoRI在缓冲液A2和A2S2中对lambda DNA的酶活性。图A：在缓冲液A2中1小时的酶活性；图B：在缓冲液A2S2中1小时的酶活性；图C：在缓冲液A2中20小时的酶活性；图D：在缓冲液A2S2中20小时的酶活性。其中，下降三角形(顶部)代表限制性核酸内切酶按照2倍连续稀释。