[发明专利]用于核酸分析的多价结合组合物

说明书

描述了多价结合组合物，其包括具有附接至颗粒的核苷酸的多个拷贝的颗粒‑核苷酸缀合物。多价结合组合物允许将可检测信号定位到生化相互作用的活性区域，例如蛋白质‑蛋白质相互作用、蛋白质‑核酸相互作用、核酸杂交或酶促反应的位点，并且可用于鉴定在聚合酶反应过程中掺入延长核酸链中的碱基的位点，并为测序和基于阵列的应用提供改进的碱基鉴别。

交叉引用

本申请是2019年9月23日提交的美国专利申请号16/579,794的部分继续申请，并要求2019年9月6日提交的美国临时申请号62/897,172和2019年5月24日提交的美国临时申请号62/852,876的权益，每个申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开一般地涉及多价结合组合物及其在分析核酸分子中的用途。特别地，本发明构思涉及一种多价结合组合物，该多价结合组合物具有附接到颗粒或聚合物核的核苷酸的多个拷贝，所述颗粒或聚合物核有效地增加核苷酸的局部浓度并增强结合信号。多价结合组合物可应用于例如，测序和生物传感器微阵列领域。

背景技术

核酸测序可用于在各种生物医学背景下获取信息，包括诊断、预后、生物技术和法医生物学。已经开发了各种测序方法，包括Maxam-Gilbert测序和链终止法，或从头测序法包括鸟枪法测序和桥式PCR，或下一代方法包括聚合酶克隆测序、454焦磷酸测序、Illumina测序、SOLiD测序、离子激流半导体测序、HeliScope单分子测序、测序等。尽管DNA测序取得了进展，但成本效益高、高通量测序面临许多挑战仍未得到解决。本公开提供了解决现有技术的许多缺点的新颖解决方案和方法。

发明内容

本文公开了确定靶核酸序列中的核苷酸身份的方法，包括：a.提供一种组合物，该组合物包含：i.所述靶核酸序列的两个或更多个拷贝；ii.与所述靶核酸序列的一个或更多个区域互补的两个或更多个引物核酸分子；和iii.两个或更多个聚合酶分子；b.在足以允许在聚合物-核苷酸缀合物与(a)的所述组合物中的所述靶核酸序列的所述两个或更多个拷贝之间形成多价结合复合物的条件下使所述组合物与所述聚合物-核苷酸缀合物接触，其中聚合物-核苷酸缀合物包含两个或更多个核苷酸部分的拷贝和任选的一种或更多种可检测标记；和c.检测所述多价结合复合物，从而确定靶核酸序列中所述核苷酸的身份。在一些实施方案中，靶核酸序列是DNA。在一些实施方案中，多价结合复合物的检测在不存在未结合的或溶液携带的聚合物-核苷酸缀合物的情况下进行。在一些实施方案中，靶核酸序列已被复制或扩增或已通过复制或扩增产生。在一些实施方案中，一种或更多种可检测标记是荧光标记。在一些实施方案中，检测多价复合物包括荧光测量。在一些实施方案中，接触包括一种类型的聚合物-核苷酸缀合物的使用。在一些实施方案中，接触包括两种或更多种类型的聚合物-核苷酸缀合物的使用。在一些实施方案中，两种或更多种类型的聚合物-核苷酸缀合物中的每一种类型都包含不同类型的核苷酸部分。在一些实施方案中，接触包括三种类型的聚合物-核苷酸缀合物的使用，并且其中三种类型的聚合物-核苷酸缀合物中的每一种类型都包含不同类型的核苷酸部分。在一些实施方案中，聚合物-核苷酸缀合物包含封闭的核苷酸部分。在一些实施方案中，封闭的核苷酸是3'-O-叠氮甲基核苷酸、3'-O-甲基核苷酸或3'-O-烷基羟胺核苷酸。在一些实施方案中，所述接触在稳定所述多价结合复合物的离子的存在下发生。在一些实施方案中，接触在锶离子、镁离子、钙离子或其任意组合的存在下进行。在一些实施方案中，聚合酶分子是非催化活性的。在一些实施方案中，聚合酶分子已通过突变或化学修饰而变为非催化活性的。在一些实施方案中，聚合酶分子已通过缺乏必要的离子或辅因子而变为非催化活性的。在一些实施方案中，聚合酶分子是催化活性的。在一些实施方案中，聚合物-核苷酸缀合物不包含封闭的核苷酸部分。在一些实施方案中，多价结合复合物具有大于2秒的持续时间。在一些实施方案中，该方法可以在25℃至62℃范围内的温度下进行。在一些实施方案中，聚合物-核苷酸缀合物进一步包含一种或更多种荧光标记，并且靶核酸序列的两个或更多个拷贝沉积、附接或杂交至表面，其中多价结合复合物在表面上的荧光图像在检测步骤中的对比噪声比大于20。在一些实施方案中，使用掺入极性质子惰性溶剂的缓冲液将(a)的组合物沉积至表面。在一些实施方案中，接触在如下条件下进行：当所述核苷酸部分与所述靶核酸序列的下一个碱基互补时稳定所述多价结合复合物，并且当所述核苷酸部分与所述靶核酸序列的所述下一个碱基不互补时使所述多价结合复合物不稳定。在一些实施方案中，所述聚合物-核苷酸缀合物包含具有多个分支的聚合物并且所述两个或更多个核苷酸部分附接至所述分支。在一些实施方案中，所述聚合物具有星形、梳形、交联、瓶刷或树枝状聚合物构型。在一些实施方案中，所述聚合物-核苷酸缀合物包含一个或更多个选自亲和素、生物素、亲和标签及其组合的结合基团。在一些实施方案中，该方法进一步包括使(a)的组合物与聚合物-核苷酸缀合物之间形成的所述多价结合复合物不稳定的解离步骤，所述解离步骤能够去除所述聚合物-核苷酸缀合物。在一些实施方案中，该方法进一步包括将与靶核酸序列的下一个碱基互补的核苷酸掺入所述两个或更多个引物核酸分子中的延伸步骤。在一些实施方案中，延伸步骤与所述解离步骤同时发生或在所述解离步骤之后发生。