[发明专利]使用改进的氧化方案制备寡核苷酸的方法

说明书

本发明涉及一种用于产生混合的P＝O/P＝S主链寡核苷酸的方法，所述方法包括使用通过将碘、有机溶剂和水混合得到的氧化溶液，根据方案使式I的中间体亚磷酸三酯化合物选择性地氧化成式II的磷酸二酯化合物，其特征在于，所述氧化溶液已经熟化一个时间段，所述时间段足以使所述式I的亚磷酸三酯化合物选择性地氧化成所述式II的磷酸二酯化合物而不氧化硫代磷酸酯核苷酸间键合。

本发明涉及一种生产混合的P＝O/P＝S主链寡核苷酸的新方法，包括根据方案将式I的中间体亚磷酸三酯化合物氧化成式II的磷酸二酯化合物

其中氧化遵循特定的氧化方案。

寡核苷酸合成在原理上是将核苷酸残基逐步添加到生长链的5'-末端，直到组装出所需的序列。

通常，每次添加都称为合成循环，且在原理上由化学反应组成

a₁)将固相支持物上受保护的羟基基团解封，

a₂)将作为活化亚磷酰胺的第一个核苷与固相支持物上的游离羟基偶联，

a₃)氧化或硫化相应的P-连接核苷(亚磷酸三酯)以形成相应的磷酸二酯(P＝O)或相应的硫代磷酸酯(P＝S)；

a₄)任选地，将固相支持物上的任何未反应的羟基封端；

a₅)使附着在固相支持物上的第一个核苷的5'羟基解封；

a₆)将作为活化的亚磷酰胺的第二个核苷偶联以形成相应的P-连接的二聚体；

a₇)氧化或硫化相应的P-连接的二核苷酸(亚磷酸三酯)以形成相应的磷酸二酯(P＝O)或相应的硫代磷酸酯(P＝S)；

a₈)任选地，将任何未反应的5'羟基封端；

a₉)重复前面的步骤a₅到a₈，直到组装出所需的序列。

寡核苷酸合成的原理在本领域中是众所周知的(参见例如寡核苷酸合成；维基百科，免费百科全书；https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide synthesis，2016年3月15日)。

氧化步骤通常用包含碘、有机溶剂(通常是吡啶)和水的氧化溶液进行。

然而，观察到当应用新制备的氧化溶液时，不仅发生了所需的式I的中间体亚磷酸三酯化合物氧化成式II的磷酸二酯化合物，而且作为副反应，存在于分子中的硫代磷酸酯核苷酸间键合可能受位于核苷酸间键合处的P＝S到P＝O转化的影响，这导致式II的化合物中磷酸二酯键合的含量高于预期。

因此，本发明的目的是找到一种氧化方案，其允许将式I的亚磷酸三酯化合物选择性地氧化成式II的磷酸二酯化合物而不影响硫代磷酸酯核苷酸间键合。

已发现，可以通过生产混合的P＝O/P＝S主链寡核苷酸的方法达到本发明的目的，该方法包括使用由碘、有机溶剂和水混合获得的氧化溶液，根据以下方案使式I的中间体亚磷酸三酯化合物氧化成式II的磷酸二酯化合物，

其特征在于氧化溶液已经熟化一个时间段，该时间段足以使式I的亚磷酸三酯化合物选择性地氧化成式II的磷酸二酯化合物而不氧化硫代磷酸酯核苷酸间键合。

在此，阐述以下定义以说明和定义用于描述本发明的各种术语的含义和范围。