[发明专利]用于等温DNA扩增的方法和组合物

说明书

本发明涉及用于扩增DNA模板的方法，包括在核糖核苷酸存在下用DNA依赖性RNA聚合酶培养DNA模板，和通过链置换DNA聚合酶扩增DNA模板。本发明还涉及RNA聚合酶用于在DNA模板上产生核糖核苷酸引物然后通过链置换DNA聚合酶扩增DNA模板的用途，以及部件试剂盒，包括RNA聚合酶和链置换DNA依赖性DNA聚合酶，以及部件试剂盒用于扩增DNA模板的用途。

技术领域

本发明提供了用于在等温条件下复制或扩增天然或变性DNA模板的方法、组合物和试剂盒。更具体地，本发明涉及RNA聚.合酶在用于在不存在或减少外源添加的寡核苷酸引物之下扩增DNA模板的方法中的用途。

背景技术

存在几种用于扩增DNA分子的技术。这些技术包括聚合酶链反应(PCR)，这涉及在不同温度下的重复多轮反应，和几乎都会涉及链置换DNA聚合酶的等温反应。等温反应的实例包括滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)、环介导等温扩增(LAMP)(这涉及产生准环状DNA分子的特异性引物)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和切口酶扩增反应(NEAR)(这涉及在用于启动复制的DNA分子中产生切口)。

DNA分子的复制需要游离羟基，作为DNA聚合酶添加脱氧核糖核苷酸的起点。通常，外源添加与模板DNA分子互补的短单链寡核苷酸或引物，以引发DNA分子通过DNA聚合酶的复制。所述单链引物可以包含特异性核苷酸序列以扩增特异性DNA模板，或包含一个或多个通用和/或简并核苷酸序列以半随机方式扩增DNA模板。所述通用核苷酸序列包括例如随机寡核糖核苷酸、随机六聚体和随机九聚体DNA引物。

作为替代方案，DNA复制可以由共价附连于蛋白质的脱氧核糖核苷单磷酸酯引发。所述蛋白质在自然界中被某些细菌或动物病毒用于宿主细胞中的基因组复制(Salas,1991.Annu.Rev.Biochem.60:39-71)，但目前缺乏其他用途的广泛应用。此外，称为引物酶-聚合酶(PrimPol)的一类单独的酶同时包含DNA聚合酶和DNA引物酶活性，并且既可以用于引物合成，又可以用于DNA分子复制。与常规引物酶不同，所述PrimPol会产生DNA引物(Lipps et al.,2003.EMBO J 22:2516–2525)。最近发现，由嗜热栖热菌(Thermusthermophiles)中分离的PrimPol与随机引发相比时在扩增来自单个细胞的全基因组方面提供了优异的结果(Picher et al.,2016.Nature Comm 7:13296)。

在现有技术中，DNA模板的体外复制，尤其是大DNA分子，如全基因组的体外复制，主要基于多重置换扩增(MDA)。MDA是一种等温扩增方法，采用寡核苷酸引物和链置换DNA聚合酶如Phi29 DNA聚合酶呈指数扩增模板DNA分子(Dean et al.,2001.Genome Res.11(6):1095–1099；Dean et al.,2002.Proc.Natl.Acad.Sci.99(8):5261–5266)。Phi29 DNA聚合酶结合了高持续合成能力(processivity)、链置换活性和3'-5'校对核酸外切酶活性，导致DNA片段70kb的合成错误率非常低(Blanco et al.,1989.J Biol Chem 264:8935–8940；Garmendia et al.,1992.J Biol Chem 267:2594–2599；Esteban et al.,1993.J BiolChem 268:2719–26)。