[发明专利]用于核酸测序及相关应用的方法和试剂

权利要求书

1.一种对双链靶核酸分子进行测序的方法，所述方法包括：

(a)在表面上扩增物理连接的核酸复合物，以产生以正向取向和反向取向两者与所述表面结合的物理连接的核酸复合物扩增子，其中所述物理连接的核酸复合物包括：(i)所述双链靶核酸分子；(ii)所述双链靶核酸分子的第一端上的包括接头结构域的第一衔接子；以及(iii)所述双链靶核酸分子的第二端上的具有双链部分和单链部分的第二衔接子；

(b)去除(i)以所述反向取向与所述表面结合的所述物理连接的核酸复合物扩增子或(ii)以所述正向取向与所述表面结合的所述物理连接的核酸复合物扩增子；

(c)切割剩余结合的物理连接的核酸复合物扩增子的一部分，以提供包括来自一条链的信息的单链扩增子的子集和物理连接的核酸复合物扩增子的子集；

(d)对所述单链扩增子的子集进行测序，以提供源自所述双链靶核酸分子的原始链的测序读段；

(e)在所述表面上扩增物理连接的核酸复合物扩增子的子集；

(f)去除处于其它取向的所述物理连接的核酸复合物扩增子；

(g)切割剩余结合的物理连接的核酸复合物扩增子，以提供包括来自另一条链的信息的单链扩增子；以及

(h)对所述单链扩增子进行测序，以提供源自所述双链靶核酸分子的另一条原始链的测序读段。

2.一种对双链靶核酸分子进行测序的方法，所述方法包括：

(a)在表面上扩增物理连接的核酸复合物，以产生与所述表面结合的物理连接的核酸复合物扩增子的簇，其中所述物理连接的核酸复合物包括：(i)所述双链靶核酸分子；(ii)所述双链靶核酸分子的一端上的包括接头结构域的第一衔接子；以及(iii)所述双链靶核酸分子的另一端上的具有双链部分和单链部分的第二衔接子；

(b)去除在(i)所述物理连接的核酸复合物扩增子的5'端或(ii)所述物理连接的核酸复合物扩增子的3'端处与所述表面结合的所述物理连接的核酸复合物扩增子；

(c)在切割位点处切割剩余结合的物理连接的核酸复合物扩增子的至少一部分，以提供包括源自所述双链靶核酸分子的一条原始链的序列信息的单链扩增子；以及

(d)对所述单链扩增子进行测序，以提供源自所述双链靶核酸分子的所述一条原始链的测序读段。

3.根据权利要求2所述的方法，其中切割剩余结合的物理连接的核酸复合物扩增子的至少一部分包括保留与所述表面结合的至少一个物理连接的核酸复合物扩增子。

4.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括：

(e)在所述表面上扩增所述至少一个物理连接的核酸复合物扩增子，以再增殖与所述表面结合的所述物理连接的核酸复合物扩增子的簇；

(f)去除未在(b)中去除的处于其它取向的所述物理连接的核酸复合物扩增子；

(g)切割剩余结合的物理连接的核酸复合物扩增子，以提供包括源自所述双链靶核酸分子的另一条原始链的信息的单链扩增子；以及

(h)对所述单链扩增子进行测序，以提供源自所述双链靶核酸分子的另一条原始链的测序读段。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括将来自所述一条原始链的序列读段与来自另一条原始链的序列读段进行比较，以产生所述双链靶核酸分子的共有序列。

6.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其进一步包括：

标识来自所述一条原始链的序列读段和来自另一条原始链的序列读段中的序列变异，其中来自所述一条原始链和另一条原始链的所述序列变异是一致的序列变异；或者

消除或忽视在所述一条原始链中而不在另一条原始链中发生的序列变异。

7.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其进一步包括：

将来自所述一条原始链的序列读段与来自另一条原始链的序列读段进行比较；

标识来自所述一条原始链的序列读段与来自另一条原始链的序列读段之间不一致的核苷酸位置；以及

通过忽略、消除或校正已标识的所述不一致的核苷酸位置来产生所述双链靶核酸分子的错误校正的序列。