[发明专利]用于蛋白纯化的方法

说明书

本发明涉及蛋白纯化方法，特别是使用离子交换层析。提供了适用于通过离子交换层析纯化的修饰的蛋白和肽标签，以及相关方法。

技术领域

本发明涉及蛋白纯化的方法，特别是使用离子交换层析。提供了适用于通过离子交换层析纯化的修饰的蛋白和肽标签，以及相关方法。

背景技术

重组蛋白的生产需要通过从生产它们的细胞中分离它们来纯化蛋白，这通常是生产过程中最耗时和昂贵的因素。对于用于医学和治疗应用的蛋白尤其如此，因为需要非常高水平的纯度。蛋白纯化通常依赖于多步骤过程中几种技术的组合，从细胞碎片的细胞分解去除开始，接着从其他细胞蛋白和杂质中分离所需蛋白。所需的材料量和浓度、所需的天然折叠/活性、纯度、多聚体蛋白的亚基含量、翻译后修饰指导蛋白策略设计。为了设计合适的蛋白纯化方法，关键是评估蛋白溶解度，其在高或低浓度下的不稳定性及其对盐浓度、温度、pH和氧化的敏感性。此外，当旨在组合不同的纯化步骤时，希望减少或甚至废除透析和浓缩的任何中间步骤。

纯化通常涉及在纯化早期使用的批量或分批方法，其适用于大体积且有效地去除非蛋白物质(核酸、多糖和脂质)，随后是适用于获得高纯度产物的更精制的方法。批量方法包括盐析、用有机聚合物进行的相分配、用有机溶剂进行的沉淀(可导致变性)、在非常低的盐浓度下的等电沉淀、热沉淀和聚乙二醇(非离子聚合物)沉淀。注意剧烈的方法(例如加热、极端pH或用有机溶剂进行的相分配)仅适用于稳定的蛋白。沉淀是一种快速、温和、可放大和相对便宜的方法，由于对靶标的分馏和浓缩，而广泛用于实现对靶标蛋白的充分富集。硫酸铵(AS)和聚乙烯亚胺(PEI)是最广泛使用的沉淀剂。AS对蛋白结构稳定，非常可溶，相对便宜，并且允许利用盐溶入-盐溶出现象的蛋白分馏。相似地，PEI在中性pH下是带正电荷的分子，并且其与带负电荷的大分子(例如核酸和酸性蛋白)结合，形成迅速沉淀的网络。

用于纯化的精制程序通常从高容量程序进行到低容量程序，并且除其他外，包括离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、疏水相互作用层析、羟基磷灰石上的蛋白层析和固定化金属亲和层析。固定化金属亲和层析(IMAC)是基于通过强螯合剂固定在固体基质上的过渡金属离子(例如Zn2+、Cu2+、Ni2+和Co2+)与水溶液中的组氨酸和半胱氨酸的亲和力的技术。该技术通常用于结合Ni2+柱的重组His-标签蛋白(用包含6个或更多个组氨酸残基的表位表达的蛋白)。IMAC的主要优点是它的低成本、稳健性和使用的简单性，因为它也可在变性、氧化和还原条件下工作，具有相对高的亲和力和特异性。主要的限制包括需要避免螯合剂(EDTA以及潜在的螯合基团，例如Tris)，His标签序列的潜在免疫原性，镍从IMAC基质中浸出的变应原作用和污染蛋白(例如具有天然金属结合基序的蛋白、在其表面具有组氨酸簇的蛋白、例如通过陪伴分子机制与异源表达的His-标签蛋白结合的蛋白、以及对琼脂糖基支持物具有亲和力的蛋白)的共纯化。另外，IMAC不适用于对金属离子敏感的蛋白和易受氧化或蛋白水解损伤的蛋白，因为IMAC固定相对螯合剂或还原剂不耐受。

离子交换层析是分离蛋白的通用方法，经常用于分析和制备目的。离子交换层析可以实现高分辨率，同时纯化和浓缩目标物。

离子交换剂由以下组成：基础基质，通常是提供宽吸附表面的多孔珠，其上固定有带电配体，通常是带电聚合物以提高所述树脂的容量。交换剂本身是酸和碱，且它们在宽或窄pH范围上的质子化程度取决于它们是强酸强碱还是弱酸弱碱。