[发明专利]靶核酸的检测方法、核酸结合分子的检测方法、及核酸结合能力的评价方法

说明书

本发明为一种靶核酸的检测方法，是从碱基序列或修饰状态与靶核酸部分不同的非靶核酸中识别并检测靶核酸的方法，将所述非靶核酸中与所述靶核酸不同的区域作为靶区域，将所述靶核酸中与所述非靶核酸不同的区域作为对应靶区域，以供试核酸样本为模板，在与所述非靶核酸中的所述靶区域特异性结合的分子存在下，使用与所述靶核酸及非靶核双方杂交的引物，在所述分子能够与所述非靶核酸结合的温度条件下进行核酸扩增反应，基于有无扩增产物来检测靶核酸。

技术领域

本发明涉及一种识别基因突变、基因多态性、核酸的修饰等碱基序列或结构近似的多个核酸以检测目标核酸的方法、检测核酸结合分子或评价其核酸结合能力的方法、及用于这些方法的试剂盒。

本申请基于2019年10月18日在日本申请的日本特愿2019-191409号主张优先权，其内容引用于本文。

背景技术

基因的碱基序列变化导致的基因突变多是产生了仅1～数个碱基的插入、缺失、向其它碱基转化等。因而，基因突变的检测中，需要识别并检测除1～数个碱基的突变位点以外由相同的碱基序列构成的野生型核酸和突变型核酸。

作为检测DNA或RNA的1～数个碱基的突变的方法，具有多种技术。作为利用PCR(polymerase chain reaction)检测突变的方法，可列举例如使用基于荧光物质和猝灭剂的修饰寡核苷酸探针的PCR法。在该方法中，在与预测产生了突变的突变型DNA区域杂交并经荧光物质和猝灭剂修饰的寡核苷酸探针的存在下，对包含预测产生了突变的DNA区域的DNA片段进行PCR扩增反应。对于突变型DNA，该探针进行退火，通过用于PCR的DNA聚合酶的核酸外切酶活性切割探针，荧光物质和猝灭剂解离，结果反应系统中产生荧光。而在野生型DNA的情况下，该探针不进行退火，因此不会产生荧光。但是，在野生型和突变型的DNA混合存在的样品中，在进行定量评价时需要繁琐的操作，因此难以用于检测杂合突变。

另外，还有利用SURVEYOR核酸酶的SURVEYOR测定(参见非专利文献1)。该测定将经PCR扩增的对照DNA和测试DNA在试管内混合，进行热变性及重新双链化，使用SURVEYOR核酸酶切割错配碱基的3’侧，从而检测出测试DNA包含与对照DNA不同的碱基。该方法较为简便，主要用于从经基因组编辑的细胞群中提取DNA并检测基因组编辑的效率。通常，基因组编辑效率达不到100％，基因组编辑的方法也多种多样，因此无需加入对照DNA。但是，在各种基因组编辑细胞的检测中，为了检测纯合的突变，需要混合来自野生型细胞的DNA。另外，在分析各种细胞来源的情况下，通过桑格法等确定碱基序列的方法更加直接，因此通常不使用SURVEYOR测定。

此外，还有ORNi-PCR法，该方法向反应系统中添加与PCR反应中扩增的DNA区域互补的17～29碱基左右的短链RNA(寡核苷酸、ORN)(例如，参见非专利文献2)。该方法中，特异性抑制ORN与之杂交的DNA区域的PCR扩增。即，仅ORN不与之杂交的DNA被PCR扩增。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2011-103900号公报

非专利文献

非专利文献1：Zhu,et al,Scientific Reports,2014,4:6420,DOI:10.1038/srep06420

非专利文献2：Fujita,et al,DNA Research,2018,vol.25,p.395-407.

非专利文献3：Notomi,et al,Nucleic Acids Research,2000,vol.28(12),e63.