[发明专利]系列多通道显微术

说明书

本发明涉及在荧光显微术中组合多个颜色通道的快得多的方式，用于复杂的快速诊断和研究目的。优点是，可以将程序和显微镜设置简化和微型化到这样的程度，即，这样的自动系统的构造变得更容易，并且通过省略擦除步骤，分析速度更快，并且移动到由图像处理系统对图像的处理，其现在几乎实时工作。

背景技术

本发明涉及通过重复荧光标记和靶部分的成像而不在成像步骤之间降解荧光标记来检测生物试样的样品上不同的靶部分的方法。

目前用于重复荧光标记和成像的方法是循环方法，其中对靶染色，拍摄图像，并且在开始新的染色轮之前通过氧化或辐射去除染色。

例如，EP3037821公开了根据例如荧光信号用具有用于可逆荧光标记的可酶降解的间隔物的缀合物检测和分离靶部分的方法。

PCT/EP2019/060403公开了包含可酶降解的间隔物的缀合物可释放标记，其中通过在可释放间隔物和荧光染料之间插入包含一个或多个聚乙二醇的连接基团单元增加用于检测的荧光量子产率。

从EP 0810428、EP1181525、EP 1136822或EP1224472中进一步了解重复成像方法，其中生物试样的样品在序列周期中与偶联到荧光部分的抗原识别部分接触，通过荧光部分检测抗原的位置，并消除荧光部分。通过重复标记-检测-消除步骤，可以对蛋白质网络作图，可以定位不同的细胞类型，并且可以分析蛋白质组中的疾病相关的变化。

所有这些技术都涉及在成像步骤之间的脱色步骤。脱色可以涉及用化学品(如氧合试剂)或辐射处理以破坏荧光标记。除了由于这种处理对生物试样的不期望的压力之外，脱色是耗时的过程，其显著增加总的方法时间。

已经显示，通过首先加入一种试剂，随后拍照，加入第二试剂并拍照的两步过程，可以产生具有多个信息的图像。这样的方法例如由以下公开：JENNIFER PANKRATZ等人: REAIease Technology: Controlled release of antibody-fluorochrome conjugatesfor maximal flexibility in flow sorting and fluorescence microscopyappIications, CANCER RESEARCH, 第79卷, 第13期, SuppI., 2019年5月1日(2019-05-01), 第4048页; SONG等人: Expression of drebrin E in migrating neuroblastsin adult rat brain: Coincidence between drebrin E disappearance from cellbody and cessation of migration, NEUROSCIENCE, NEW YORK, NY, US, 第152卷, 第3期, 2008年1月19日(2008-01-19), 第670-682页以及CHRISTOPH HERBEL等人: MACSima(TM) Imaging Platform provides new insights into cancer biology and targetdiscovery by cyclic immunofluorescence-based imaging, MACS MORE, 第18卷,第1期, 2019年8月2日(2019-08-02), 第16-20页。

这些出版物描述了其中第一试剂识别一种基因产物的分子的子集并且第二试剂识别一种基因产物的所有分子的方法。在该出版物中，随后显示如何通过在第一和第二染色之间的简单图像减法来在各种形式之间区分。在该出版物中，由于选择的程序，每个步骤的程序耗时几个小时。

然而，已知荧光染料具有可变的光稳定性性质和/或用于染色的缀合物具有可变的与相应的靶的结合常数。此外，当被光激活时，一些荧光染料与其它荧光染料相比衰减更快。由于“被光激活”包括激发辐射，不能避免发射随时间的衰减，并且仅仅减去图像可能导致错误的或误导性的差分图像。荧光发射随时间的衰减在下文中称为“采集漂白”。

发明内容