[发明专利]多核苷酸的高效无模板酶促合成

权利要求书

1.合成具有预定序列的多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供具有游离3'-羟基的起始子；和

b)重复以下循环：(i)在延长条件下使具有游离3'-O-羟基的起始子或延长的片段与3'-O-封闭的核苷三磷酸和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体接触，使得通过掺入3'-O-封闭的核苷三磷酸来延长起始子或延长的片段以形成3'-O-封闭的延长的片段，和(ii)解封闭所述延长的片段以形成具有游离3'-羟基的延长的片段，直至合成多核苷酸，其中第一TdT变体用选自第一组3'-O-封闭的核苷三磷酸延长起始子或延长的片段，以及不同于第一TdT变体的第二TdT变体用选自第二组3'-O-封闭的核苷三磷酸的3'-O-封闭的核苷三磷酸来延长起始子或延长的片段，并且其中所述第一TdT变体以比所述第二TdT变体更高的效率用来自所述第一组的3'-O-封闭的核苷三磷酸来延长所述起始子或延长的片段，并且所述第二TdT变体以比所述第一TdT变体更高的效率用来自所述第二组的3'-O-封闭的核苷三磷酸来延长所述起始子或延长的片段。

2.如权利要求1所述的方法，其中不同于所述第一TdT变体和所述第二TdT变体的第三TdT变体用选自第三组3'-O-封闭的核苷三磷酸的3'-O-封闭的核苷三磷酸来延长所述起始子或延长的片段，并且其中所述第一TdT变体以比所述第二TdT变体或第三TdT变体更高的效率用来自所述第一组的3'-O-封闭的核苷三磷酸来延长所述起始子或延长的片段，第二TdT变体以比第一TdT变体或第三TdT变体更高的效率用来自第二组的3'-O-封闭的核苷三磷酸来延长所述起始子或延长的片段，以及第三TdT变体以比第一TdT变体或第二TdT变体更高的效率用来自第三组的3'-O-封闭的核苷三磷酸来延长所述起始子或延长的片段。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一组包含3'-O-封闭的脱氧腺苷三磷酸、3'-O-封闭的脱氧胞苷三磷酸和3'-O-封闭的脱氧胸苷三磷酸，并且所述第一TdT变体包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含以下取代组合：A17V+L52F+G57E+M63R+A108V+K147R+C173G+R207L+M210Q++R325V+E328K+N345E+R351K。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述第一TdT变体包含以下取代组合：A17V+Q37E+D41R+L52F+G57E+M63R+S94R+G98E+A108V+S146E+K147R+Q149R+C173G+M184T+R207L+K209H+M210Q+G284L+E289A+R325V+E328K+N345E+R351K。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第二组包含3'-O-封闭的脱氧鸟苷三磷酸，以及所述第二TdT变体包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含以下取代组合：A17V+L52F+G57E+M63R+I76V+A108V+C173G+R207L+F259E+Q261R+K265G+R325V+E328N+R351K。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述第二TdT变体具有以下取代组合：A17V+Q37E+D41R+L52F+G57E+M63R+I76V+S94R+G98E+A108V+S146E+Q149R+C173G+M184T+R207L+K209H+F259E+Q261R+K265G+G284L+E289A+R325V+E328N+R351K。

7.末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，其包含与SEQ ID NO:1所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％同一性的氨基酸序列，并且(ii)与SEQ ID NO:1相比，具有以下取代组合：A17V+L52F+G57E+M63R+A108V+K147R+C173G+R207L+M210Q+R325V+E328K+N345E+R351K。