[发明专利]多核苷酸的高效无模板酶促合成

说明书

本发明涉及多核苷酸的酶促无模板合成的组合物和方法，其中使用不同的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体将不同的3'‑O‑可逆封闭的脱氧核苷三磷酸(dNTP)掺入到生长链中。部分地，本发明认识和理解到，可以设计不同的TdT变体，以比单一“通用”TdT变体更高的效率优先掺入特异性dNTP，所述单一“通用”TdT变体用于掺入所有四种3'‑O‑可逆封闭的dNTP。

发明背景

使用多种长度的预定序列的高度纯化的廉价多核苷酸已经成为包括基因组和诊断测序多重核酸扩增/治疗性抗体开发、合成生物学、基于核酸的治疗剂、DNA起源、基于DNA的数据存储等在内的多种技术的核心。最近，在通过使用无模板聚合酶的基于酶的方法，例如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，补充或替代基于化学的合成方法方面产生了兴趣,因为这类酶的经证实的效率和温和的无毒反应条件的益处，例如Ybert等人的国际专利公开WO2015/159023；Hiatt等人的美国专利5763594；Jensen等人，Biochemistry,57:1821-1832(2018)等。大多数基于酶的合成方法需要使用可逆封闭的核苷三磷酸，以便在多核苷酸产物中获得所需的序列。不幸的是，与未修饰的核苷三磷酸相比，天然TDTs以降低的效率掺入这种修饰的核苷三磷酸。因此，大量的工作已经致力于开发对于修饰的核苷三磷酸具有更好掺入效率的新的TdT变体，例如Champion等，美国专利公开US2019/0211315；Ybert等，国际专利公开WO2017/216472等。

鉴于上述情况，如果新的无模板聚合酶，如新的TdT变体，以及使用方法可用于可逆性封闭的核苷三磷酸的改进掺入，则将促进无模板酶促多核苷酸合成领域的发展。

发明概述

本发明涉及用于多核苷酸的无模板酶促合成的方法、组合物和试剂盒，所述多核苷酸包括末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体，所述变体在不同的反应环境下，包括(i)当掺入不同种类的可逆封闭的核苷三磷酸时，和(ii)在所需产物的多核苷酸中间体中不同的二级结构(例如发夹，交叉链杂交体，链内杂交体，G-四联体等)的存在下，在掺入核苷三磷酸中显示增强的效率。更具体地，本发明部分地认识和理解到，可以工程化不同的TdT变体以引入具有不同效率的不同种类的3'-O-封闭的核苷三磷酸，并且通过在相同的方法中使用具有不同种类的3'-O-封闭的核苷三磷酸或3'-O-封闭的核苷三磷酸的子集的不同的TdT变体，可以使用这种效率上的差异来改善总体合成效率。同样，本发明部分地认识和理解到，不同的TdT变体可以被工程化以在可以在多核苷酸中间体中形成的不同二级结构的存在下掺入3'-O-封闭的核苷三磷酸。

在一些实施方案中，本发明涉及包含末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体(“ACT-TdT变体”)的组合物，所述末端脱氧核苷酸转移酶变体包含与SEQ ID NO：1的氨基酸至少百分之九十相同的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO：1具有以下取代：A17V+L52F+G57E+M63R+A108V+K147R+C173G+R207L+M210Q+R325V+E328K+N345E+R351K，其中TdT变体(i)能够合成没有模板的核酸片段，并且(ii)能够以比参比的TdT高的速率将3'-O-修饰的dATP、dCTP或dTTP中的每一个掺入到核酸片段的游离3'-羟基上，所述参比的TdT对于所有dNTP显示出基本上相等的掺入速率。

在一些实施方案中，本发明涉及包含末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体(“G-TdT变体”)的组合物，所述变体包含与SEQ ID NO：1的氨基酸至少百分之九十相同的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO：1具有以下取代：A17V+L52F+G57E+M63R+176V+A108V+C173G+R207L+F259E+Q261R+K265G+R325V+E328N+R351K，其中TdT变体(i)能够合成没有模板的核酸片段，并且(ii)能够以比参比的TdT高的速率将3'-O-修饰的dGTP掺入到核酸片段的游离3'-羟基上，所述参比的TdT对于所有dNTP显示出基本上相等的掺入速率。

在一些实施方案中，SEQ ID NO:2的TdT变体(M27)用作参考的TdT，以评估和比较其它TdT变体，例如ACT-TdT或G-TdT变体的掺入速率。