[发明专利]细胞选择的方法

权利要求书

1.一种选择包含编码目标产物的核酸序列的真核细胞的方法，所述方法包括：

i)使在不存在酪氨酸的情况下不能存活或生长的细胞群与载体系统接触，所述载体系统包含：

a)第一核酸序列，包含编码缺乏功能性N末端调节域的苯丙氨酸羟化酶(PAH)的序列并可操作地连接到使所述PAH能够在宿主细胞中表达的第一控制序列；

(b)第二核酸序列，包含编码GTP环化水解酶1(GCH1)的序列并可操作地连接到使所述GCH1能够在宿主细胞中表达的第二控制序列；和

(c)第三核酸序列，包含编码目标产物的序列并可操作地连接到使所述产物能够在宿主细胞中表达的第三控制序列，在允许细胞摄取所述载体系统的条件下，所述第三序列存在于与(a)和/或(b)相同的载体中；

ii)在酪氨酸水平低于不表达由所述载体系统编码的所述PAH和GCH1酶的细胞存活或生长所需水平的条件下培养所述细胞；和

iii)选择一种或多种能够在此类条件下生长的细胞以获得一种或多种含有编码所述产物的所述核酸序列的细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中(a)、(b)和(c)存在于同一载体中。

3.根据权利要求1或2所述的方法，包含两个载体，其中(c)存在于与(a)或(b)相同的载体中。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞，例如CHO细胞。

5.根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，其中所述PAH具有N末端调节域的缺失。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基缺乏酪氨酸并且任选地补充有苯丙氨酸。

7.一种真核宿主细胞，包含：

a)第一外源性核酸，包含编码缺乏功能性N末端调节域的苯丙氨酸羟化酶(PAH)的序列并可操作地连接到使所述PAH能够在所述宿主细胞中表达的第一控制序列；和

b)第二外源性核酸，所述第二外源性核酸编码GTP环化水解酶1(GCH1)并可操作地连接到使所述GCH1能够在所述宿主细胞中表达的第二控制序列；和

c)第三外源性核酸，所述第三外源性核酸编码目标产物并可操作地连接到使所述产物能够在所述宿主细胞中表达的第三控制序列，所述第三外源性核酸存在于与所述第一和/或第二外源性核酸相同的外源性核酸序列中。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中所述PAH具有所述N末端调节域的缺失。

9.根据权利要求7或8所述的宿主细胞，其中所述PAH是CHO或人PAH。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO细胞。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的宿主细胞，其中第一、第二和第三核酸分子被整合到所述宿主细胞的基因组中。

12.根据权利要求7至10中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞的编码PAH和/或GCH1的内源性基因的活性已降低或消除。

13.一种包含一种或多种核酸载体的载体系统，所述核酸载体包含：

a)第一核酸序列，包含编码缺乏功能性N末端调节域的苯丙氨酸羟化酶(PAH)的序列并可操作地连接到使所述PAH能够在宿主细胞中表达的第一控制序列；

b)第二核酸序列，包含编码GTP环化水解酶1(GCH1)的序列并可操作地连接到使所述GCH1能够在宿主细胞中表达的第二控制序列；和

c)多克隆位点，用于插入编码目标产物的序列并可操作地连接到使所述产物能够在宿主细胞中表达的第三控制序列，其中所述多克隆位点和所述第三控制序列存在于与(a)和/或(b)相同的载体中。