[发明专利]细胞选择的方法

说明书

本文描述了生产细胞和用于基于编码缺乏功能性N末端调节域的苯丙氨酸羟化酶(PAH)的序列和编码GTP环化水解酶1(GCH1)的序列的组合鉴定、选择或培养包含酪氨酸营养缺陷型选择标记系统的生产细胞的方法。还描述了制备生产细胞和用所述生产细胞制备产物的方法。

技术领域

本公开涉及用于鉴定、选择或培养包含主题核酸序列的细胞的方法和组合物。

背景技术

细胞表达系统普遍用于生产重组生物制品，如治疗性生物制剂。生产线细胞的开发涉及将编码目标重组产物的核酸构建体引入宿主细胞，并选择含有这些核酸构建体的细胞。这一般涉及使细胞承受选择压力以有利于已经吸收外源核酸的细胞。早期的选择标记系统使用抗生素抗性标记，但已有远离使用此类系统的趋势。一些替代系统基于补充代谢缺陷，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)和谷氨酰胺合成酶(GS)。然而，仍然需要新的可以用于选择用于生产重组生物制品的细胞的选择系统。进一步地，由于越来越多地使用生产宿主细胞工程策略，那些涉及引入修饰宿主细胞特性的新序列的策略将受益于选择系统，该选择系统与用于引入编码生物制品的序列的现有或未来选择系统不同。

发明内容

本发明涉及一种基于酪氨酸营养缺陷型的选择系统和无需在培养基中包括酪氨酸的重组产物的制造。我们发现，仅基于苯丙氨酸羟化酶(PAH-其催化苯丙氨酸转化为酪氨酸)的系统是无效的，并且有必要包括与酪氨酸生物合成相关的第二酶，即GTP环化水解酶1(GCH1)。进一步地，我们发现与全长酶相比，使用带有去除N末端调节域的截短的PAH提供了显著的优势。使用全长CHO PAH导致转染后在无酪氨酸培养基中没有恢复或恢复时间慢得多，而分子的截短(tPAH)形式能够实现良好的恢复。PAH和GCH1的组合让细胞在与不表达这些酶的类似细胞相比酪氨酸水平较低(例如，在不存在酪氨酸的情况下)的条件下生长。

因此，在第一方面中，本发明提供了一种包含一种或多种核酸载体的载体系统，该核酸载体包含：

a)第一核酸序列，包含编码缺乏功能性N末端调节域的苯丙氨酸羟化酶(PAH)的序列并可操作地连接到使该PAH能够在宿主细胞中表达的第一控制序列；

b)第二核酸序列，包含编码GTP环化水解酶1(GCH1)的序列并可操作地连接到使该GCH1能够在宿主细胞中表达的第二控制序列；和

c)多克隆位点，用于插入一个或多个编码目标产物的序列并可操作地连接到使该产物能够在宿主细胞中表达的第三控制序列。

在相关方面，本发明还提供了一种包含一种或多种核酸载体的载体系统，该核酸载体包含：

a)第一核酸序列，包含编码缺乏功能性N末端调节域的苯丙氨酸羟化酶(PAH)的序列并可操作地连接到使该PAH能够在宿主细胞中表达的第一控制序列；

b)第二核酸序列，包含编码GTP环化水解酶1(GCH1)的序列并可操作地连接到使该GCH1能够在宿主细胞中表达的第二控制序列；和

c)第三核酸序列，包含编码目标产物的序列并可操作地连接到使该产物能够在宿主细胞中表达的第三控制序列。

此类载体可以被引入宿主细胞和那些含有在不让非转化细胞高效生长的酪氨酸限制条件下所选择的载体的细胞。因此，在第二方面，本发明提供了一种宿主细胞，包含：

a)第一外源性核酸，包含编码苯丙氨酸羟化酶(PAH)的序列并可操作地连接到使该PAH能够在宿主细胞中表达的第一控制序列；和

b)第二外源性核酸，其编码GTP环化水解酶1(GCH1)并可操作地连接到使该GCH1能够在宿主细胞中表达的第二控制序列；和

c)第三外源性核酸，其编码目标产物并可操作地连接到使该产物能够在宿主细胞中表达的第三控制序列。

在一个实施例中，第一、第二和第三核酸分子被整合到宿主细胞的基因组中。