[发明专利]用于基因编辑的TAL效应物核酸酶

说明书

公开了TALEN组合物和使用方法，其包括使用多重组合物同时在若干基因诸如FAD3 A/B/C基因中产生靶突变，使用组合物在单个基因诸如编码FAD2蛋白的基因中产生靶突变，及其组合。所述组合物和方法可以提供与相应的未经改变的植物、植物部分或植物细胞相比具有改进的特性的经基因编辑的植物、植物部分和植物细胞。例如，还提供了大豆植物、植物部分和植物细胞，其能够产生含有油的种子，其与不存在靶突变的相应种子相比具有相对较高水平的油酸和较低水平的亚油酸和亚麻酸。

序列表

本申请包含已以ASCII格式电子提交的序列表，该序列表通过援引整体并入本文。所述ASCII副本创建于2020年11月19日，命名为1702_029PCTl_SL.txt，大小为47,037字节。

背景技术

利用稀有切割核酸内切酶(rare-cutting endonuclease)进行的基因编辑可用于产生缺失、插入和启动同源重组。转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)是一种稀有切割核酸内切酶，其可以在DNA中靶向特定序列并产生精准断裂。一个TALEN设计过程的基础是识别约15个碱基对(bp)的左半TALEN(HT)，接着约15-18bp的间隔区和约15bp的右HT识别序列(参见，例如美国专利8,450,471)。该方法针对预期靶标提供高水平的特异性；然而，多重基因编辑能力将是有利的。

发明内容

本公开的方面涉及使用稀有切割核酸内切酶例如TALEN来编辑基因(例如，通过引入突变)的组合物和方法。

在一个方面，本文提供了一种组合物，其包含：第一核酸，其编码能够与第一靶基因的第一半位点序列结合的第一转录激活因子样(TAL)效应物核酸酶单体；和第二核酸组。每种第二核酸编码能够与所述第一靶基因或一组第二靶基因的第二半位点序列结合的第二转录激活因子样(TAL)效应物核酸酶单体。在该组合物中，第一半位点序列是保守序列，所述第一半位点序列和每种第二半位点序列不同并且由间隔序列隔开，以及所述第一TAL效应物核酸酶单体能够与每种第二TAL效应物核酸酶形成二聚体，从而提供TALEN的组。

在一些实施方式中，当所述第一TAL效应物核酸酶单体与所述第一半位点序列结合并且所述第二TAL效应物核酸酶单体与所述第二半位点序列结合时，所述二聚体可以在活细胞内切割所述靶基因。

在一些实施方式中，第一半位点序列是100％保守序列。在一些实施方式中，间隔序列的长度为约15至约18个核苷酸。

在一些实施方式中，第一核酸包含FokI核酸内切酶结构域。在一些实施方式中，每种第二核酸包含FokI核酸内切酶结构域。

在一些实施方式中，第一核酸在载体中。在一些实施方式中，每种第二核酸在载体中。在一些实施方式中，第一核酸和编码第二TAL效应物核酸酶单体的第二核酸组在单个载体中。

在一些实施方式中，第一核酸是质粒中的mRNA。在一些实施方式中，每种第二核酸是质粒中的mRNA。在一些实施方式中，第一核酸和第二核酸组是质粒中的mRNA。

在一些实施方式中，第二核酸组包括三种或更多种第二核酸。在一些实施方式中，第二核酸组包括四种或更多种第二核酸。

在一些实施方式中，第一靶基因是大豆(Glycine max)基因的FAD3家族的基因。在一些实施方式中，每种第二靶基因是大豆基因的FAD3家族的基因。

在一些实施方式中，第一靶基因是大豆FAD3A基因的等位基因。在一些实施方式中，第一靶基因是大豆FAD3B基因的等位基因。在一些实施方式中，第一靶基因是大豆FAD3C基因的等位基因。在一些实施方式中，第二靶基因是大豆FAD3A基因的等位基因。在一些实施方式中，第二靶基因是大豆FAD3B基因的等位基因。在一些实施方式中，第二靶基因是大豆FAD3C基因的等位基因。