[发明专利]用于富集膜泡和增加糖蛋白产量的无细胞提取物制备方案

权利要求书

1.一种在无细胞糖蛋白合成(CFGpS)反应中通过在无细胞反应混合物中协调转录、翻译和糖基化来合成糖基化的蛋白质的方法，其中所述反应混合物包含无细胞级分，所述无细胞级分通过以下获得：裂解原核细胞以获得裂解的细胞，将裂解的细胞以大于5,000×g且小于20,000×g的力进行离心分离，收集上清液以获得无细胞级分，所述方法包括：

(i)在无细胞反应混合物中转录和翻译蛋白质；

(ii)用至少一种多糖将反应混合物中的蛋白质糖基化以获得糖基化的蛋白质。

2.权利要求1的方法，其中将裂解的细胞以大于5,000×g且小于18,000×g的力进行离心分离。

3.权利要求1的方法，其中将裂解的细胞以大于5,000×g且小于15,000×g的力，例如以约12,000×g的力进行离心分离。

4.权利要求1的方法，其中相对于通过将裂解的细胞以大于15,000×g的力进行离心分离而获得的无细胞级分，无细胞级分富集膜囊泡。

5.权利要求4的方法，其中膜囊泡具有约10nm至约500nm的平均有效直径。

6.权利要求4的方法，其中膜囊泡具有约50nm至约200nm的平均有效直径。

7.权利要求4的方法，其中膜囊泡含磷脂囊泡。

8.权利要求4的方法，其中无细胞级分包含浓度为至少约4×10¹²、5×10¹²或6×10¹²或7×10¹²个颗粒/ml的膜囊泡。

9.权利要求4的方法，其中原核细胞表达对无细胞反应混合物中的蛋白质进行糖基化的跨膜寡糖基转移酶，并且膜囊泡包含所述跨膜寡糖基转移酶。

10.权利要求4的方法，其中原核细胞表达对无细胞反应混合物中的蛋白质进行糖基化的外源跨膜寡糖基转移酶，并且膜囊泡包含所述外源跨膜寡糖基转移酶。

11.权利要求9的方法，其中跨膜寡糖基转移酶选自PglB、PglO和STT3。

12.权利要求10的方法，其中跨膜外源寡糖基转移酶选自PglB、PglO和STT3。

13.权利要求4的方法，其中膜囊泡包含脂质连接的寡糖(LLO)供体，并且蛋白质通过LLO供体被糖基化。

14.权利要求1的方法，其中裂解的细胞是通过进行超声处理获得的。

15.权利要求1的方法，其中裂解的细胞是通过进行均质化获得的。

16.权利要求1的方法，其中原核细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。

17.一种用于进行糖蛋白的协调转录、翻译和糖基化的无细胞蛋白质合成平台，所述平台包括无细胞级分，所述无细胞级分通过以下获得：裂解原核细胞以获得裂解的细胞，将裂解的细胞以大于5,000×g且小于20,000×g的力进行离心分离，收集上清液以获得无细胞级分。

18.权利要求17的平台，其中将裂解的细胞以大于5,000×g且小于18,000×g的力进行离心分离。

19.权利要求17的平台，其中将裂解的细胞以大于5,000×g且小于15,000×g的力，例如以约12,000×g的力进行离心分离。