[发明专利]用于富集膜泡和增加糖蛋白产量的无细胞提取物制备方案

说明书

公开了用于制备富集膜囊泡的无细胞提取物的方案以及所公开的提取物在无细胞糖蛋白合成方法和平台中用于增加糖蛋白产量的用途。

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明是在由国防威胁降低局(DTRA)授予的HDTRA1-15-1-0052下在政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

相关专利申请的交叉引用

本申请要求根据35U.S.C.§119(e)属于2019年10月25日提交的美国临时专利申请号62/926,166的优先权的权益，其内容通过引用整体并入本文。

背景技术

本发明的领域涉及用于进行无细胞糖蛋白合成的组合物和方法。特别地，本发明的领域涉及用于制备富集膜囊泡的无细胞提取物的方案及其在用于进行无细胞糖蛋白合成和增加糖蛋白产量的方法和平台中的用途。

蛋白质糖基化是用糖部分对氨基酸侧链进行酶促修饰，在细胞功能、人类健康和生物技术中起关键作用。然而，研究和生产确定的糖蛋白仍然具有挑战性。无细胞糖蛋白合成(CFgPS)系统，其中蛋白质合成和糖基化在粗细胞提取物中进行，提供了应对这些挑战的新方法。然而，需要更好的组分和方案以提高糖蛋白产量并简化已知的CFgPS系统和方法。在此，发明人公开了用于制备富集膜囊泡的无细胞提取物的方案。本发明人的提取物可用于进行无细胞糖蛋白合成和增加糖蛋白产量的方法和平台。

发明内容

所公开的主题涉及用于制备无细胞提取物的方案，其中所述提取物富集膜囊泡，所述膜囊泡包含用于糖基化的组分。所公开的提取物可用于无细胞糖蛋白合成(CFGpS)反应和平台，以显著增加糖蛋白的产量。特别地，所公开的无细胞提取物可用于在无细胞糖蛋白合成(CFGpS)反应中通过无细胞反应混合物中的协调转录、翻译和糖基化来合成糖基化的蛋白质，以便增加糖蛋白的产量的方法和平台。

附图说明

图1.粗CFE提取物中膜囊泡的表征。(A)粗提取物和SEC纯化的囊泡的DLS分析。粗提取物踪迹是半透明的以显示重叠。误差条代表三个独立制备的提取物的一式三份分析中的标准偏差。对于纯化的囊泡，误差条代表对最浓缩的囊泡洗脱级分的一式三份分析的标准偏差。(B)在粗CFE提取物中检测到的颗粒图示。(C)粗提取物的Cryo-EM显微照片。黑色箭头指示具有明显单层形态的囊泡。白色箭头指示嵌套或多层形态。裁剪的图像指示代表性的囊泡。比例尺为100nm。(D)SEC纯化的囊泡的Cryo-EM显微照片。裁剪的图像指示代表性的纯化的囊泡。比例尺为100nm。

图2.提取物处理影响囊泡尺寸分布和浓度。(A)提取物处理条件的图示。对于所示的每种条件，一式三份制备提取物。(B)超声处理的(蓝色)和均质化的(绿色)提取物中囊泡的纳米颗粒追踪分析(NTA)浓度分析。星号指示用于提取物制备的基本条件。对于NTA分析，误差条代表三个独立制备的提取物的测量的标准偏差。(C)超声处理的(蓝色)和均质化的(绿色)S30提取物中囊泡的NTA颗粒尺寸分布(PSD)。(D)超声处理的(蓝色)和均质化的(绿色)S12提取物的NTA PSD。

图3.异源膜结合的货物可以通过膜囊泡可控地富集。使用α-FLAG Western印迹针对(A)糖基化酶和(B)信号转导蛋白的异源蛋白来定量S12和S30提取物中异源膜蛋白的富集。(C)没有跨膜螺旋的细胞溶质sfGFP对照。在每个Western印迹上，左侧泳道是S12提取物，右侧泳道是S30提取物。黑色箭头指示目标膜蛋白。来自蛋白质阶梯标准的分子量(kDa)显示在每个印迹的左侧。蛋白质名称和条带的富集比(S12/S30)直接显示在每个印迹下方。所有印迹是3个独立实验的代表。卡通图描绘了每种蛋白质的跨膜拓扑结构。有关分类起源、跨膜拓扑、功能、理论尺寸和UniProt ID，参见补充表1。(D)用荧光α-FLAG抗体探测的提取物的SEC分析荧光色谱图。用于制备提取物的菌株富集无膜蛋白(灰色迹线)、PglB(深紫色迹线)或PglO(浅紫色迹线)。来自3个独立实验的特征性囊泡洗脱级分以灰色突出显示。