[发明专利]使用透析过滤缓冲液强化的病毒过滤

说明书

纯化包含感兴趣的生物分子和杂质的样品的方法和系统，包括在生物反应器中表达所述感兴趣的生物分子，以形成包含所述感兴趣的生物分子和杂质的产物样品；将所述产品样品进行过滤以形成澄清的产物样品；将所述澄清的产物样品进行亲和层析法以去除杂质；随后将所述产物样品进行透析过滤，然后进行病毒过滤和任选的浓缩。透析过滤步骤中(和因此在病毒过滤步骤中)使用的缓冲液是产物最终配方所需的缓冲液。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年12月12日提交的美国临时申请号62/947,082和于2020年7月8日提交的美国临时申请号63/049,293的优先权。各申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及用于纯化生物分子包括治疗抗体和含Fc的蛋白质的高效工艺和系统。

背景技术

制造生物分子如蛋白质或者病毒尤其是重组蛋白质的一般方法通常涉及两个主要步骤：(1)蛋白质在宿主细胞中表达，然后(2)蛋白质的纯化。第一个步骤涉及将所需宿主细胞于生物反应器中生长以引导蛋白质的表达。为此目的使用的细胞系的一些例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤(NSO)细菌细胞如大肠杆菌和昆虫细胞。当蛋白质以所需水平表达，蛋白质就会从宿主细胞中取出收获。悬浮颗粒如细胞、细胞碎片、脂质和其他不溶物质通常会在下游纯化方法从含有蛋白质的液体中移除，得到澄清的含有感兴趣蛋白质和其他可溶性杂质的溶液。

第二个步骤涉及收获的蛋白质的纯化以移除方法过程中固有的杂质。收获物和下游操作的主要目标是将产物(例如表达的蛋白质)与可溶/不可溶杂质分开。杂质的例子包括宿主细胞蛋白质(HCP，不是所需或靶蛋白质的蛋白质)、核酸、内毒素、病毒、蛋白质变体、蛋白质聚集物和细胞培养基成分/添加剂。这种纯化特别涉及几种层析法步骤，其包括在固体基质例如多孔琼脂、聚合物或玻璃或膜基吸附物上的亲和层析法、结合/洗脱模式阳离子交换层析法、流式阴离子交换层析法、疏水性相互作用等中的一或多种。

一个方法模板的例子包括通过离心进行初步澄清，通过过滤进行二次澄清，和一系列层析方法，其涉及结合/洗脱模式的蛋白质A亲和性，然后是结合/洗脱模式的阳离子交换，然后是流式阴离子交换。蛋白质A柱通过亲和机制捕获感兴趣的蛋白质或靶蛋白质，而大块杂质通过柱被丢弃。之后，蛋白质通过从柱中洗脱而回收。由于大部分感兴趣的蛋白质的等电点(PI)在碱性(8-9)范围，因此在通常加工条件(pH低于蛋白质PI)是带正电荷的，它们被结合在第二柱的阳离子交换树脂上。其他带正电荷的杂质也被结合在此树脂上。然后感兴趣的蛋白质在杂质保持与树脂结合的情况下(pH,盐浓度)从这个柱中洗脱以回收。阴离子交换柱是典型地以流式模式操作，这样任何带负电荷的杂质结合树脂，而带正电荷的感兴趣的蛋白质都在流经流体中回收。接下来是下游纯化方法，可以进行病毒过滤，然后是超滤/透析过滤以调节缓冲系统和在最终填充单元操作之前浓缩产物以完成制造方法。此方法产生高度纯化和浓缩的蛋白质溶液，这对用于人类且必须通过卫生当局如食品药品监督管理局(FDA)批准使用的治疗蛋白质来说可能尤其重要。

图1说明了一个传统方法。此方法包括细胞收获步骤，其涉及使用离心法以移除细胞培养液中的细胞和细胞碎片，然后使用深层过滤。细胞收获步骤之后是捕获步骤，如蛋白质A亲和纯化步骤，然后是病毒灭活。病毒灭活后通常有一或多个层析法步骤，也被称作精制(polishing)步骤，其通常包括阳离子交换层析法和/或阴离子交换层析法和/或疏水性相互作用层析法和/或混合模式层析法和/或羟磷灰石层析法中的一或多种。所述精制步骤后是病毒过滤和超滤/透析过滤，以完成这个方法。

捕获步骤可使用蛋白质A树脂，如A树脂，其是刚性的蛋白质A亲和层析法树脂，或者Ultra Plus介质，两种都可从EMD Millipore公司购买，特别是含有Fc区域的抗体。其它以结合和洗脱模式操作的树脂也可适用于捕获。结合和洗脱层析法包括(1)产物上上样至靶结合量，(2)产物从柱中洗脱和(3)清洁以准备树脂再次使用。