[发明专利]使用与固体表面结合的亲和配体分离和离析核酸

说明书

本发明公开了通过将靶标大分子(诸如DNA(双链或单链)、RNA(双链或单链)、信使RNA或其它低核苷酸或寡核苷酸)与结合于表面的亲和配体结合，从样品中离析和分离靶标大分子的方法。所述方法可用于色谱法或任何其他分离科学。

相关应用的交叉引用

本申请要求于2019年11月25日提交的美国临时专利申请号62/939,934的优先权。前述申请的全部内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开涉及使用结合到表面的特定选择的亲和配体从进料流或通常从样品中分离、离析和去除靶标大分子(诸如DNA和RNA)的方法。

背景技术

色谱法(正如通常使用的)是一种分离样品混合物中各种成分的技术。在液相色谱系统中，依次将样品和洗脱液注入色谱分离柱。分离柱含有可与待分离样品的各种组分相互作用的填料或基质介质或材料。分离介质的组成取决于被引导通过其中的流体，以实现所需的分离。当样品和洗脱液通过分离介质时，由于不同的相互作用，样品的各种组分以不同的速率通过分离介质。这些组分在出口或分离介质的流出物中分离出来。

本领域已知各种类型的垂直和水平流分离柱。随着高效液相色谱的需要，开发了水平流型色谱柱。这种水平或径向流柱在例如美国专利号4,627,918和4,676,898中有描述。在水平或径向流型柱中，样品和洗脱流体通过分配器引入分离介质或基质的外周或周壁或表面，流体水平或径向向内通过分离介质到达中心或收集口，然后以不同的时间和不同的速率从柱中洗脱。

后来，开发了直接处理粗进料的色谱柱和方法，以分离生物活性物质，包括细胞/发酵收获物、组织提取物和血浆/血液。将大珠层析介质装入标准低压色谱柱中，用大孔筛(60-180μm孔)代替端板筛。大孔防止色谱柱堵塞。由于颗粒大小较大，细胞物质在颗粒间腔中的珠之间流动，而可溶性产物被珠上的官能团捕获。

传统上，来自细胞培养/发酵收获的生物制品的下游处理需要两个主要操作：回收和纯化。回收涉及通过离心和/或微滤去除细胞和其他颗粒物质，以及初始的减容步骤，通常为超滤。由于常规色谱介质会被细胞碎片迅速污染，因此必须为纯化操作准备无颗粒进料。

在(治疗性)生物制品(诸如单克隆抗体)的某些纯化过程中，通过活细胞系统(哺乳动物、细菌、苔藓、藻类、植物等)产生样品/产物，并且产物或者由细胞分泌到进料流中，或者细胞被破碎以将产物释放到周围的液体中。然而，在所有这些生产系统中，产物不是作为单一组分纯产物提供的，而是作为所需产物和“污染物”的非常复杂的混合物，其中包括宿主细胞蛋白质(HCP)和基因组DNA以及RNA。

在纯化过程中，必须将纯化产物中的HCP和DNA/RNA去除至低于监管机构(诸如FDA)设定的限值水平。这种纯化常常通过阴离子离子交换法实现。在过滤和纯化含有蛋白质的样品期间，可能难以在不使目的蛋白质退变的情况下将蛋白质与其他细胞组分和宿主蛋白质分离，并且难以离析靶标蛋白质。一种常见的方法是通过沉淀；然而，这可能导致蛋白质的变性或退变，这可能导致蛋白质功能的丧失。蛋白质的重折叠通常会导致活性丧失。快速蛋白质液相色谱(FPLC)是蛋白质纯化中常用的方法。在不必使用高压或侵蚀性pH缓冲液使蛋白质变性的情况下，可仅使用缓冲液与离析目的蛋白之间的特异性相互作用来纯化蛋白质。

仍然需要一种从进料流中去除和离析双链和单链DNA和RNA的系统。

发明内容

公开了从样品中分离靶标大分子的方法，包括以下步骤：选择将会与靶标大分子结合的亲和配体；将亲和配体结合到表面以产生偶联的表面亲和配体；将偶联的表面亲和配体放置于容器中；将含有靶标大分子的样品引入偶联的表面亲和配体，并使偶联的表面亲和配体与样品孵育一段停留时间，其中靶标大分子与亲和配体结合；以及将结合靶标大分子的偶联的表面亲和配体与从中去除了了靶标大分子的样品分离。任选地，所述方法包括收集基本上不含靶标大分子的洗脱液和/或从偶联的表面亲和配体洗脱和回收靶标大分子。