[发明专利]全基因组扩增和分析生物样品中的靶分子的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种用于全基因组扩增和分析生物样品中的多个靶分子的方法，所述生物样品包含基因组DNA和靶分子，所述方法包括以下步骤：

a)提供生物样品；

b)使生物样品与至少一种结合剂接触，所述至少一种结合剂针对与标记的寡核苷酸缀合的至少一种靶分子，所述标记的寡核苷酸包含：

i)核酸的有效载荷序列(PL)，其包含结合剂条形码序列(BAB)和唯一分子标识符序列(UMI)，和

ii)核酸的至少一个第一标记的寡核苷酸扩增序列(5-TOS)；

使得-当生物样品中存在至少一种靶分子时-至少一种结合剂与至少一种靶分子结合；

c)进行分离步骤，以选择性地去除未结合的结合剂，从而获得标记的生物样品；

d)对标记的生物样品进行：

-所述基因组DNA的全基因组扩增，其通过：

i)确定性限制性位点全基因组扩增(DRS-WGA)，或

ii)基于多重退火和成环的扩增循环全基因组扩增(MALBAC)，和

-与至少一种结合剂缀合的标记的寡核苷酸的扩增，

其中全基因组扩增和标记的寡核苷酸的扩增同时进行；

e)从扩增的标记的寡核苷酸制备大规模平行测序文库；

f)对大规模平行测序文库进行测序；

g)从每个测序读取中检索结合剂条形码序列(BAB)和唯一分子标识符序列(UMI)的序列；

h)计算每种结合剂的不同的唯一分子标识符序列(UMI)的数量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述标记的寡核苷酸还包含至少一个第二标记的寡核苷酸扩增序列(3-TOS)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述唯一分子标识符序列(UMI)是10至30个核苷酸范围内的简并或半简并序列。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括从所述生物样品中分离单细胞的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述分离步骤通过分选细胞来进行。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述分离步骤通过将细胞分成液滴来进行。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中，所述分离步骤在步骤c)之后和步骤d)之前进行。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括在步骤f)之前纯化所述大规模平行测序文库的步骤。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一种结合剂选自由以下组成的组：

a)抗体或其片段，

b)适体，

c)小分子，

d)肽，和

e)蛋白质。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述靶分子选自由以下组成的组：

a)蛋白质，

b)肽，

c)糖蛋白，

d)碳水化合物，

e)脂质，和

f)其组合。

11.根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中，所述标记的寡核苷酸从5'到3'至少包含：

a)核酸的第一标记的寡核苷酸扩增序列(5-TOS)，其依次包含5'全基因组扩增句柄序列(5-WGAH)和第一扩增句柄序列(1AH)；

b)有效载荷序列(PL)；

c)核酸的第二标记的寡核苷酸扩增序列(3-TOS)，其依次包含核酸的第二扩增句柄序列(2AH)和3'全基因组扩增句柄序列(3-WGAH)。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述全基因组扩增和所述标记的寡核苷酸的扩增使用单一引物进行。