[发明专利]全基因组扩增和分析生物样品中的靶分子的方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于全基因组扩增和分析包括基因组DNA和靶分子的生物样品中的多个靶分子的方法，包括以下步骤：使生物样品与至少一种针对至少一种与标记的寡核苷酸缀合的靶分子的结合剂接触的步骤，该标记的寡核苷酸包含结合剂条形码序列(BAB)和唯一分子标识符序列(UMI)；进行分离步骤以选择性地去除未结合的结合剂，从而获得标记的生物样品；同时对标记的生物样品进行全基因组扩增和标记的寡核苷酸的扩增；从扩增的标记的寡核苷酸制备大规模平行测序文库；对大规模平行测序文库进行测序；从每个测序读取中检索BAB和UMI的序列；计算每种结合剂的不同UMI的数量。

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2019年12月16日提交的意大利专利申请号102019000024159的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及用于生物样品、特别是单细胞样品中的靶分子的全基因组扩增和分析，特别是蛋白质定量的方法和试剂盒。

现有技术

单细胞分析方法允许获得有关细胞状态的信息，而没有因批量样品中的异质性而导致的复杂化。对同一单细胞中的蛋白质组和基因组进行分析，可以提供细胞表型与其基因型之间的相关性，从而对不同的生物学和病理过程有独特的见解。对于肿瘤尤其如此，在肿瘤中，体细胞获得的遗传异质性及其对转录和蛋白质翻译的影响是癌症开始和演变的关键因素。

全基因组扩增(WGA)可用于分析来自单细胞的基因组，以获得更多的DNA并简化和/或允许不同类型的遗传分析，包括测序、SNP检测等。从EP1109938中已知基于确定性限制位点(DRS-WGA)的具有LM-PCR的WGA。

WO 2017/178655和WO 2019/016401教导了一种从DRS-WGA(例如Amplil^TMWGA)或MALBAC制备大规模平行测序文库的简化方法以用于低通全基因组测序和拷贝数分析。

最近，已开发出同时分析单细胞的基因组和转录组的方法。Dey S.等人的论文，2015年，同一细胞的综合基因组和转录组测序(Integrated genome and transcriptomesequencing of the same cell.)，Nature Biotechnology，33(3)，285-289，http://doi.org/10.1038/nbt.3129，教导了一种方法，通过该方法，来自手工分离的单细胞的信使RNA首先被转录为单链cDNA，然后通过拟线性全基因组扩增与基因组DNA一起扩增。然后制备和测序两个不同的文库，一个来自cDNA，一个来自基因组DNA。在另一种方法中，Macaulay,I.C.等人，2015，GT-seq：单细胞基因组和转录组的平行测序(GT-seq:Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes)，NatureMethods，12(6)，519-522.http://doi.org/10.1038/nmeth.3370，使用oligo-dT包被的珠子使mRNA与gDNA物理分离，以从完全裂解的单细胞中捕获并分离出多聚腺苷酸化的mRNA分子。然后使用修饰的Smart-seq2方案扩增mRNA(Picelli,S.等人,2013,将Smart-seq2用于单细胞中的灵敏度全长转录组分析(Smart-seq2 for sensitive full-lengthtranscriptome profiling in single cells)，Nature Methods，10(11)，1096-1100.http://doi.org/10.1038/nmeth.2639)，而gDNA可以使用可用的全基因组扩增方法进行扩增和测序。这些方法虽然有助于将基因型与信使转录联系起来，但不能直接检测在细胞中被积极调节的蛋白质、其翻译和翻转/降解。